备战2025年高考二轮复习课件 生物（通用版）：生物技术与工程 素养整合.pptVIP

2.反向PCR技术反向PCR技术是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。【例2】反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是()注:引物分别与临近的DNA链互补配对。A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增B.设计的引物中G、C碱基含量越高,复性的温度越低C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶答案A【归纳总结】当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术,反向PCR技术所依据的原理是:用限制性内切核酸酶切割该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。如下图所示:3.不对称PCR正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物,那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫作不对称PCR。【例3】(2024·山东临沂一模节选)研究人员常用DNA分子杂交技术检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上,检测时用标记的目的基因单链片段作为探针。不对称PCR能够大量制备单链DNA片段,其基本原理是采用不等量的一对引物,经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物,结果获得大量单链DNA(ss-DNA)。若反应体系中原有100个模板DNA,最初10个循环后限制性引物耗尽,再进行20个循环,理论上可制备ss-DNA(用科学计数法表示),在这30个循环中ss-DNA的产生量主要受的影响。?放射性同位素2.048×106限制性引物和非限制性引物的比例【归纳总结】不对称PCR主要只扩增一条模板链,实际操作时,为了增加模板量,也可以加入一对引物,只是两条引物在浓度上应存在差异。如此题经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物。此技术可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。4.实时荧光定量RT-PCR实时荧光定量RT-PCR主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化,实时分析目的基因的初始量,该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。RT表示逆转录。在RT-PCR中,通过逆转录酶将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。【例4】“实时荧光定量RT-PCR”是一种用于实时扩增和检测特定DNA或RNA序列的分子生物学技术。TaqMan探针是实时荧光定量RT-PCR技术中一种常用探针(如图1),其5端连接荧光基团(R),3端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时,R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中,当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到,荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题。图1图2素养整合?诠释应用素养科学思维与科学探究——PCR技术及应用【素养提炼】1.重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。这项技术目前主要有两个应用方向:基因定点突变;构建融合基因。【例1】重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术,其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(如图中的引物2和3,突起处代表与模板链不能互补的突变位点),分别进行PCR,获得有重叠链的两种DNA片段,再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图所示。(1)若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为(假设引物为单链DNA)。?T—A或C—GA或G(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中,引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系