生物技术药物质量控制.ppt

体内测定：即整体动物测定，能为较大范围的重组产品的效价提供有用信息，但费时、昂贵、难操作及同时存在伦理问题，大多数情况下倾向于选择体外测定方法。体外测定：可使用分离的器官或组织、原代细胞或传代细胞系，目前最常用方法是连续生长、因子依赖的、克隆化的细胞系的方法，其测定结果比较准确、重现性好、经济、容易使用和便于统计分析。0102体内测定和体外测定方法生物学活性测定方法选择对生产工艺稳定，生物学活性测定方法复杂，可采用其他替代方法（如重组人生长激素用HPLC定量方法代替复杂生物活性测定方法）。通过研究首先选择能够定量评价的方法，最好的选择是背景较低的反应，并且对相关产品有陡峭的、可重复的剂量-反应曲线；其次考虑半定量方法（如NGF），最后考虑定性（如BMP）方法。0102012、定量、半定量、定性方法生物学活性测定方法选择3H-thymidine、BrdU是反映DNA合成、增殖细胞1数的比例的。BrdU：首先用BrdU做标记，固定细2胞，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗BrdU抗3体发生反应。4MTT（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以5定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶6物MTTformazan,二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙7醇或酸化的SDS均能溶解紫色结晶物，通过比色法测8定MTTformazan的量可以反映线粒体电子传递系统9机能，间接表示细胞的生长状态。10细胞培养法中细胞染色标记方法AlamarBlue：氧化型AlamarBlue（600nm）可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料（570nm）发生颜色和荧光改变，颜色和荧光的深浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧光检测仪检测。Crystalviolet：染活细胞后，在比色计中测定光吸收值（A），A值与着染色细胞数成正比。12 几种细胞培养测定方法比较 3H-thymidineBrdUMTT AlamarBlue 靶向物DNA合成系统 线粒体电子传递系统 检出细胞的状态增殖 增殖、生存检出法 放射活性 色素、荧光 色素 色素、荧光抽出的必要性 + ++- 其他试剂的必要性+ ++ +- 成本（以MTT为1时） 6080-100（试剂盒）1 2缺点 使用同位素 不适合检出大量未增殖检出未增浮游细胞细胞，处理时费力殖活细胞 生物学活性测定分析方法1、用能诱导50%最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价（或滴度），或以此稀释度中所含样品的量为1单位，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的单位数。2、比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测样品的实验结果。活性标准品待测样品稀释度abA值生物学测定基本模式图04030102比活性：每毫克蛋白质的生物学活性单位。蛋白质的空间结构不能常规测定，而它的改变（如二硫键的错误配对）可影响蛋白质的生物学活性，从而影响药效，比活性可以反映此种情况。比活性可反映产品生产工艺的稳定情况，可比较不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质量情况。比活性是重组蛋白质药物不同于化学药的一项