研究方法和手段.ppt

1通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交。2同核体：相同基因型的细胞融合而成。3异核体：不同基因型的细胞融合而成。4自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。5诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。6诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。细胞融合用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程图第三节细胞组分的分级分离01离心技术是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。03转速25kr/min，离心力89Kｇ者称为超速离心机。04目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。02转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。一、分离细胞亚显微结构和大分子的超速离心法差速离心Differentialcentrifugation特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。12345可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。HighspeedDifferentialcentrifugationLowspeed010203（二）密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、平衡沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。01特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。02原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。031、速度沉降velocitysedimentation2.平衡沉降equilibriumsedimentation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。所需的力场通常比速度沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation可以分离蛋白质的层析法又称色谱法在本世纪初，俄国植物学家茨维特(M．Tswett)将植物色素的石油醚提取液倾入装满碳酸钙颗粒的玻璃管中，再加入石油醚使其自由流下，结果植物色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的色谱带。这种方法被称为色谱法。装碳酸钙的玻璃管称为色谱柱(Column)，管内装的填料(如碳酸钙)称为固定相(Stationaryphase)，淋洗液(如石油醚)称为流动相(mobilephase)。层析法实质上是一种物理化学分离方法：即利用混合物中各组分在两相(固定相和流动相)中溶解、析出、吸附、脱附、或其他亲和力和渗透性的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而得到互相分离。按两相的物态分类：用气体作流动相称为气相层析(gaschromatography．简称GC)，用液体作流动相称为液相层析(1iquidchromatography，简称LC)。按固定相所处的形式分类：柱层析、纸层析、薄层层析按分离过程的物化原理分类：吸附层析法、分配层析、离子交换层析、凝胶层析法、亲和层析离子交换层析(ionexchangechromatography)利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。凝胶过滤层析利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，又称之为排阻层析。亲和层析在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueand