常见的生化与分子生物学技术课件.pptVIP

;生物大分子的提取和纯化;;;生物大分子分离纯化的一般步骤和原则

;要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：

在水和各种有机溶剂中的溶解性。

在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。

固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。

各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。

其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。

对其他生物分子的特殊亲和力。

;分离纯化的一般程序;生物大分子的浓缩;超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。

透析浓缩法

减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。

冰冻干燥法

;纯度鉴定;蛋白质、核酸的定性定量检测;;电泳基本原理;电泳;影响泳动度的因素：

1.电场强度：

电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。

2.溶液pH

为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。

3.离子强度（I）

溶液的I越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。

;;;;2.琼脂糖凝胶电泳;;;;;凝胶聚合的原理及有关特性

影响凝胶聚合的因素

AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP应在干燥、避光的条件下保存，其水溶液应置棕色瓶中，4℃冰箱贮存，一般仅能存放一周。TEMED（液状）应密闭贮于4℃冰箱中。增加AP和TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。

pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减少AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。

温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温(5℃)聚合凝胶会变得脆而混浊，一般25-35℃聚合较好。

氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱气，再加引发剂。;;;;以分离应用领域过程分类

微滤(micro-filtration,MF)

超滤(untra-filtration,UF)

反渗透(reverseosmosis,RO)

透析(Dialysis,DS)

电透析(electro-dialysis,ED)

纳米膜分离(NF)

亲和过滤(affinityfiltration,AF)

渗透气化(pervaporation,PV;;;;透析和超滤;;透析方法示意图;沉淀与离心;;离心机的使用;;层析;表1主要的层析方法及其原理;层析基本操作过程;洗脱装置;;;离子交换层析

;原理;选择离子交换剂的一般原则：;;离子交换树脂分离氨基酸;分子筛示意图;亲和层析示意图;;;亲和层析的操作条件

亲和柱层析装柱方法与凝胶层析相同，层析操作与离子交换层析相似。但由于亲和层析的对象都是生物分子，为防止生物大分子变性，常在低温(4℃)下进行。亲和层析柱所用的平衡缓冲液应与样品缓冲液一致，pH一般在近乎中性的范围内。上柱时流速应尽可能缓慢。上柱后，用大量平衡缓冲液洗去杂质，然后用洗脱液洗脱亲和物。洗脱结束后，继续用洗脱液洗涤，直至无亲和物为止。最后用平衡缓冲液使亲和层析柱平衡，即可重复使用。暂时不用时，亲和层析柱应置于4℃低温保存。;蛋白质研究方法;蛋白质纯化;蛋白质和酶纯化的

常见方法和方案设计;;蛋白质纯度的鉴定;;;等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI;蛋白质一级结构的测定;Western印迹;;蛋白质组学(proteomics);蛋白质的双向电泳;;1.样品制备

样品的制备是实验成败的关键，需根据不同的研究目的来决定具体的实验方法。

蛋白样品的有效溶解是成功分离蛋白质的最关键的因素之一。可以根据样品性质的不同，选用具有单一的增溶作用的溶液，还可用含多种变性剂、去垢剂、还原剂的复杂混合溶液，以使样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体完全破坏。;制备样品的原则;蛋白样品应在等电聚焦前新鲜配制，或-80℃分装冻存，绝对避免将样品反复冻融。

通过超离心去除所有颗粒性物质，因为颗粒性物质或脂会阻塞凝胶孔路。;为了防止蛋白质被修饰，加入尿素后，不要加热蛋白样品。当样品中含有尿素时，加热绝对不要超过37℃.升高温度会使尿素水解成异氰酸