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蜂蜜中链霉素与双氢链霉素残留量的液相色谱串联质谱法测定

一、1.仪器与试剂

(1)本实验采用Agilent1290InfinityII高效液相色谱仪，配备电喷雾电离源（ESI）的Agilent6490TripleTOF质谱仪，用于蜂蜜中链霉素和双氢链霉素残留量的测定。液相色谱仪配备二元泵、自动进样器、柱温箱和在线脱气系统，确保样品分析的准确性和重现性。质谱仪具有高灵敏度和高分辨率，能够实现对目标化合物的快速检测和精确定量。

(2)实验中使用的试剂包括乙腈（色谱纯，Merck）、甲醇（色谱纯，Merck）、磷酸二氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）和氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。乙腈和甲醇用于样品的提取和洗脱，磷酸二氢钠和氨水用于制备提取溶液。所有试剂在使用前均经过适当处理，以确保实验结果的准确性和可靠性。

(3)实验过程中使用的色谱柱为AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm），该柱适用于多种分析物的高效分离。流动相为乙腈-水溶液，其中乙腈与水的比例为80:20（v/v），流速为0.4mL/min。柱温设置为30℃，进样量为10μL。质谱仪的扫描范围为m/z100-1000，碰撞能量设置为20eV。通过优化这些条件，实现了对蜂蜜中链霉素和双氢链霉素残留量的快速、准确测定。

二、2.样品前处理

(1)样品前处理是蜂蜜中链霉素和双氢链霉素残留量测定的关键步骤之一。首先，将蜂蜜样品在室温下搅拌均匀，以确保样品的均匀性。然后，准确称取一定量的蜂蜜样品（通常为10g）至50mL具塞离心管中。向离心管中加入适量的乙腈溶液（如30mL），涡旋混合均匀，以提取样品中的目标化合物。随后，将混合液以4000r/min的转速离心10分钟，取上清液转移至新的50mL具塞离心管中。

(2)为了进一步净化提取液，取上清液10mL至另一50mL具塞离心管中，加入适量的阳离子交换树脂（如Dowex1×8，100-200mesh），涡旋混合均匀。将混合液通过预先用乙腈溶液平衡的C18固相萃取柱（如500mg/6mL），流速控制在1mL/min。收集流出液，并在50mL容量瓶中定容至刻度，得到待测溶液。此步骤有助于去除样品中的杂质，提高检测的灵敏度和准确性。

(3)在进行液相色谱-串联质谱分析前，需要对待测溶液进行适当的稀释。根据样品中链霉素和双氢链霉素的浓度，选择合适的稀释倍数。通常，将待测溶液稀释至10ng/mL左右，以确保在质谱分析中能够获得合适的信号强度。稀释后的溶液经过0.22μm滤膜过滤，以去除可能存在的微粒，确保进样时的稳定性和重现性。经过前处理后的样品即可进行液相色谱-串联质谱分析，从而实现对蜂蜜中链霉素和双氢链霉素残留量的准确测定。

三、3.液相色谱串联质谱条件优化

(1)在液相色谱串联质谱条件优化过程中，首先对液相色谱的流动相进行了调整。实验中比较了乙腈-水和甲醇-水两种流动相体系，并优化了乙腈与水的比例为80:20（v/v）。在此条件下，链霉素和双氢链霉素的保留时间分别约为8.5分钟和9.2分钟，峰形尖锐，分离效果良好。此外，通过对比不同流速（0.2mL/min、0.4mL/min和0.6mL/min）对分离效果的影响，最终确定流速为0.4mL/min，既保证了分离效果，又提高了分析效率。

(2)对于电喷雾电离源（ESI）的液相色谱串联质谱条件优化，首先对扫描方式进行了比较。实验中采用了正离子扫描和负离子扫描两种模式，发现正离子扫描模式下链霉素和双氢链霉素的响应信号更强。在此基础上，进一步优化了碰撞能量（CE），通过对比20eV、40eV和60eV三种碰撞能量下的响应信号，确定碰撞能量为40eV时，两种化合物的响应信号均达到最佳。此外，还优化了扫描范围，将扫描范围设置为m/z100-1000，以覆盖目标化合物的分子离子和碎片离子。

(3)在优化液相色谱串联质谱条件的过程中，还考虑了内标法的应用。实验中选取了链霉素和双氢链霉素的代谢产物或同位素作为内标，如链霉素-D3和双氢链霉素-D3。通过比较不同内标添加量（0.1ng、0.5ng和1ng）对定量结果的影响，发现添加量为0.5ng时，定量结果的准确性和稳定性均达到最佳。同时，对内标溶液的制备过程进行了优化，确保内标溶液的浓度和稳定性，从而提高整个分析过程的准确性和可靠性。通过以上条件优化，成功实现了蜂蜜中链霉素和双氢链霉素残留量的准确测定。

四、4.定量分析及结果评价

(1)定量分析过程中，采用内标法定量测定蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的残留量。实验中选取了链霉素-D3和双氢链霉素-D3作为内标，其添加量固定为0.5ng。通过优化液相色谱串联质谱条件，得到了两种目标化合物及其内标的准确保