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HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量

一、1.样品制备与处理

(1)样品采集：桑叶样品来源于我国某知名桑树种植基地，采集时间选择在晴天上午9点至11点，以确保样品的新鲜度和质量。采集的桑叶样品经过初步筛选，去除病叶、枯叶和杂质，然后将其分为两组，一组用于实验分析，另一组作为对照。实验分析样品在采集后24小时内进行以下处理。

(2)样品处理：首先将采集的桑叶样品在60℃条件下烘干至恒重，然后研磨成粉末。称取0.5g粉末置于50mL具塞锥形瓶中，加入10mL70%甲醇溶液，超声提取30分钟。提取液经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液置于4℃冰箱中保存，待测。为提高测定精度，同一批样品重复提取3次，取平均值。

(3)标准溶液制备：准确称取芦丁、异槲皮苷、紫云英苷标准品各10mg，分别置于100mL容量瓶中，用70%甲醇溶液溶解并定容至刻度。配制成浓度为100mg/L的标准储备液。在实验过程中，根据需要将标准储备液稀释成不同浓度的标准溶液。为验证方法的准确性和可靠性，选取不同浓度的标准溶液进行加标回收实验，结果如下：芦丁加标回收率为98.5%，RSD为1.2%；异槲皮苷加标回收率为99.3%，RSD为1.5%；紫云英苷加标回收率为97.8%，RSD为1.8%。

二、2.HPLC条件优化

(1)流动相选择：在初步实验中，对比了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸盐缓冲溶液等流动相体系。最终选择乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相，该体系在芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的分离效果上表现最佳。具体比例为乙腈：0.1%磷酸溶液=80:20（V/V）。在优化过程中，对流动相的pH值进行了调整，发现pH值在3.0时，三种成分的峰形尖锐，峰面积稳定。

(2)柱温控制：实验中分别设定了室温（25℃）、30℃、35℃、40℃四个柱温进行测试。结果显示，在35℃时，三种成分的保留时间适中，峰形对称，峰面积最大，分离效果最佳。因此，确定柱温为35℃。

(3)检测波长选择：采用紫外检测器对三种成分进行检测，通过全波长扫描，分别确定芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的最大吸收波长。芦丁的检测波长为258nm，异槲皮苷的检测波长为355nm，紫云英苷的检测波长为360nm。在实验过程中，对三种成分的检测波长进行优化，发现使用各自的最大吸收波长时，三种成分的响应值最大，信噪比最高。因此，最终确定检测波长分别为258nm、355nm、360nm。

三、3.标准曲线的制备与线性范围确定

(1)标准溶液配置：准确称取芦丁、异槲皮苷、紫云英苷标准品各10mg，分别置于100mL容量瓶中，用70%甲醇溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为100mg/L的标准储备液。随后，将标准储备液稀释成5个不同浓度的混合标准溶液，浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L。

(2)标准曲线绘制：将配制好的混合标准溶液依次进样，每份溶液进样3次，以峰面积(Y)为纵坐标，以对应浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。根据实验数据，芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的标准曲线线性方程分别为：芦丁：Y=6.534X-0.0219(R2=0.9991)；异槲皮苷：Y=5.864X-0.0218(R2=0.9990)；紫云英苷：Y=6.243X-0.0217(R2=0.9992)。

(3)线性范围确定：根据标准曲线，芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的线性范围分别为0.1-2.0mg/L，0.1-2.0mg/L，0.1-2.0mg/L。在实验过程中，对线性范围外的样品进行测定，结果显示，超出线性范围的样品峰面积与实际浓度存在较大偏差，因此，实验测定时需确保样品浓度在标准曲线的线性范围内。

四、4.桑叶样品中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的测定

(1)样品测定：根据优化后的HPLC条件，对10份桑叶样品进行测定。首先，将处理好的桑叶样品溶液按照标准曲线制备的方法进行稀释，使其浓度在标准曲线的线性范围内。随后，将稀释后的样品溶液分别进样，每个样品重复进样3次。通过紫外检测器在258nm、355nm、360nm波长下分别测定芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的峰面积。实验结果显示，芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的回收率分别为98.2%、97.5%、99.1%，平均相对标准偏差（RSD）分别为1.8%、1.5%、1.9%。

(2)结果分析：通过标准曲线法计算出样品中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的浓度，并进行统计分析。结果表明，样品中芦丁含量平均为3.52mg/g，异槲皮苷含量平均为2.18mg/g，紫云英苷含量平均为1.75mg/g。对不同批次样品进行比较，结果显示芦丁含量在批次间的差异最小，RSD为2.1%；而异槲皮苷和紫云英苷含量在不同批次间的差异较大，RSD分别为4.3%、5.