质粒图谱的阅读.ppt

Targetgene转化菌具有氨苄青霉素抗性，可在加有氨苄青霉素的平板上生长。白色菌落含插入序列蓝色菌落无插入序列使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。.载体自身环化，产生蓝色菌落；未转化的细胞，不能生长。WhitecoloniesrepresentAmpicillin-resistantbacteriathatcontainpInsertanddonotproduceLacZalphafragment.BluecoloniesrepresentAmpicillin-resistantbacteriathatcontainpVectorandexpressafunctionalalphafragmentfromanintactLacZalphacodingsequence.Insituhybridization原位杂交生长在琼脂糖平板上的菌落，可定点转移到硝酸纤维素膜上，加入放射性的探针（即带有放射性的与目的片断互补的核酸片断），与菌落杂交。经洗涤后的膜与X－光胶片作用，挑选出阳性克隆。平末端连接*RecombinantDNA1T4DNAligase2vector3141平末端连接的缺点2moredifficultligation连接困难32-directioninsertion双向插入4self-reconnection自身环化5noeasywayofretrieving theinsert6重新筛选插入的片断困难vector12vector12AABAB平齐末端连接时，插入的方向是随机的，称为双向插入。会给后续的工作造成很多麻烦。单酶切粘末端连接*01EcoRI02EcoRI单酶切粘末端连接的特点*优点*Usingthesameoneenzymetocut1用同一种酶切2Ligatedeasilyandcoveniently3连接容易方便4缺点*Self-reconnectionofvector5载体自身环化6Insertedintwodirections7双向插入8单酶切粘末端的双向插入*AATTCGAATTCGGCTTAAGCTTAAGCTTAAAATTCGAATTCGGCTTAA*AATTCxxxxxxAGxxxxxxTTCGAGAGCTTCTTAAAGAATTCxxxxxxAAGCTTCTTAAGxxxxxxTTCGAAligase双酶切粘末端连接EcoRIHindIIIEcoRIHindIII双酶切粘末端连接的特点*Usingthesametwoenzymestocut01Ligatedeasilyandconveniently02noself-reconnectionofvector03Insertedinonedirection定向插入04缺点操作比较麻烦。如果两种酶要求的条件不同，需要进行两个阶段的反应。05几种实验方法*利用相应的技术方法，使实验顺利进行。Linkofhomopolymerictails末端转移酶添加同聚尾避免质粒的自身环化添加接头，引入限制酶的切割位点，然后用相应的酶切割。第三节重组子导入细胞*野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统，会切割外源DNA分子。因此用于基因工程的受体菌，需经筛选和人工改造。外源DNA转入细胞的过程叫做转化。但不包括由病毒介导的DNA转入。常用的方法有两种：ThefirstisachemicalmethodutilizingCaCl2andheatshocktopromoteDNAentryintocells.氯化钙法：利用氯化钙和热休克使受体菌成为感受态细胞，促进外源DNA的进入。宿主细胞与重组DNA在00C的氯化钙溶液中孵育，快速转入420C造成热休克。经此处理后的细胞“容易”接受外源的DNA，一般叫做感受态细胞。处理宿主细胞低渗溶液＋热休克E.coli+0.1M