细胞的换液与传代.pptVIP

教学目的：掌握传代培养的概念和方法了解细胞系的建立过程掌握克隆细胞的几种方法21有限细胞系finitecellline:不能继续传代或传代数有限。细胞株cellstrain：通过选择法和克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质和标志的培养物。连续细胞系continuouscellline：可连续传代的细胞系，即已建成的细胞系。3细胞系cellline：原代培养物经首次传代后即成。有关概念传代培养（passage）1概念：无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。2传代培养的方法（一）传代培养的方法1、从生长器皿上解离细胞的方法：1）震荡法。2）胰蛋白酶消化法3）胰蛋白酶-柠檬酸盐4）用EDTA洗细胞再用胰蛋白酶-柠檬酸盐处理5）EDTA洗再用胰蛋白酶-EDTA消化6）EDTA洗再用胰蛋白酶-胶原酶配合柠檬酸盐或EDTA消化7）机械刮削法（scraping）8）分散酶（0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1-1.01mg/ml)2.单层培养细胞的一般传代步骤:倒出旧液PBS洗涤胰蛋白酶消化吸出消化液加入培养液吹散细胞计数稀释培养离心法：离心后去上清，加培养液，吹打，传代。直接传代法：将细胞慢慢沉淀，将上清吸去1/2-2/3，加培养基，传代。悬浮细胞的传代培养传代时机与传代培养的细胞密度：细胞没生长到足以覆盖的瓶底壁的大部分表面前，不要急于传代。传代数或代数：指对培养物传代的次数。尽量少传代，避免转化。传代培养的注意事项正常细胞系建立的程序包括：原代培养第一次传代常规传代和冻存、复苏等阶段。细胞系的建立传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；02细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代时间等；01要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；另外，细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。04多种细胞维持传代，要防止交叉污染；03细胞系的维持证明细胞系的种系。染色体分析、同工酶分析、DNA指纹技术。明确细胞系的组织来源细胞抗原标记的方法细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化正常细胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体。、细胞有无交叉污染。同工酶方法是快速有效的，每一个细胞系在琼脂糖电泳上有特异的同工酶带型。DNA指纹技术也可以鉴定。鉴定细胞系的内容：、细胞克隆01细胞克隆（clone）是指单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。细胞克隆化培养（cellcloningculture）：又称单个细胞分离培养，是指将单个细胞在一定支持物上增殖培养而产生细胞群落的过程。02稀释铺板法饲养层克隆法胶原膜板琼脂克隆法等01分类：02（一）克隆培养技术稀释铺板法图解稀释铺板法：最常用消化—低密度细胞悬液制备—接种—标记与培养—分离扩大培养—观察—移植瓶或皿内培养注意事项：确保一个细胞轮廓清晰完整，体积适宜健康不需换液饲养细胞（feedercell）：也称滋养细胞，是一层经过射线或丝裂霉素C处理过的供其它细胞附着的细胞层。成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。注意：3周内饲养细胞即死亡，要及时应用饲养层克隆法饲养层克隆图解胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法：胶原膜板或血纤维蛋白膜板的制备消化、稀释、接种和培养待克隆细胞血纤维蛋白膜板制备A液：0.2μg凝血酶,100ml培养液B液:250mg牛血纤维蛋白原、800mgNaCl、25mg柠檬酸钠、1000毫升双蒸水A：B=4：12%琼脂母液--45℃水浴--混合成0.33%琼脂培养液加入试管内2.5ml--45℃水浴琼脂克隆法：用于病毒转化细胞、恶性转化细胞。琼脂克隆法图解