靶向高通量测序在检测结核患者利福平和利福布汀耐药的应用研究 .pdf

靶向高通量测序在检测结核患者利福平和利福布汀

耐药的应用研究

【摘要】本研究探讨靶向高通量测序（tNGS）技术对诊断结核患者的利福平和

利福布汀耐药的应用价值。采用回顾性队列研究，收集2020-2023年深圳市第

三人民医院119例培养阳性结核患者的分枝杆菌菌株，tNGS检测rpoB基因耐药

突变情况，其中46株结核分枝杆菌（MTB）中检出了14种不同型别的rpoB基因

突变，包括43例rpoB基因耐药相关突变和3例529位密码子同义突变。以利福

平及利福布汀最小抑菌浓度（MIC）表型药敏结果为金标准，tNGS方法检测利福

平和利福布汀耐药的敏感度均为100%,异度为96.2%和89.4%,具有良好的诊

断性能。其中rpoB基因531、526位突变与利福平和利福布汀的耐药高度相关。

在此基础上，tNGS检测23例结核患者临床原始痰标本与对应菌株结果一致，对

18例多次分枝杆菌培养阳性患者的83株MTB菌株进行tNGS检测，结果显示2

例MTB初始无突变患者后续检出rpoB基因突变同时利福平和利福布汀表型药敏

变为耐药。综上，tNGS检测可显示rpoB基因突变类型，减少同义突变造成的假

阳性结果，对诊断利福平和利福布汀耐药具有良好的检验性能；tNGS可直接检

测临床痰标本，还可用于动态监测MTB分子耐药谱变化。

【关键词】结核分枝杆菌；靶向高通量测序；利福平；耐药

耐药结核病是严重公共卫生威胁，阻碍着WHO（WorldHealthOrgaizatio

,世界卫生组织）实现“2035年全球终止结核病这一目标［1］。利福平和

利福布汀同属于利福霉素类药物，利福平作为最有效的一线抗结核药物，其耐药

发生严重影响结核病患者的治愈率和死亡率。利福霉素类药物耐药发生的原因明

确，由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)编码RNA聚合酶B

亚基(RNApolymeraseb-subuit,rpoB)的基因发生突变，使药物无法有效

抑制细菌的转录而产生耐药［2］。临床上常使用PCR扩增结合荧光或生物素探

针反应的快速分子检测技术，诊断MTB感染和rpoB耐药突变［3-5］。国内也

有研究采用恒温扩增技术，如环介导等温扩增、滚环扩增，进行MTB感染诊断和

耐药基因检测［6-7］o

靶向高通量测序技术(targetedextgeeratiosequecig,tNGS)属

于二代测序技术其中一种，通过选择指定的一个或多个基因及片段扩增，靶向筛

选构建文库再上机测序，可一次性对几百万条以上耐药相关核酸分子进行序列测

定，是近两年WHO重点关注与推进的新型结核分子药敏检测方法［8-9］otNG

S不但能显示具体的突变类型还能检测各个点的突变频率高低，如何分析这些结

果与表型药敏的相关性，相关研究仍需深入。因此，本研究以诊断利福平与利福

布汀耐药为切入点，采用tNGS方法检测rpoB基因耐药突变，分析突变检出情况、

耐药诊断性能及不同时间或不同标本类型的tNGS检测结果的变化，有助于评估

tNGS检测对诊断利福平和利福布汀耐药的临床应用。

一、材料与方法

样(一本)收集

采用回顾性队列研究，收集来自2020-2023年深圳市第三人民医院119例

结核病患者的结核分枝杆菌培养阳性的菌株样本，其中23例患者保留了对应的

临床原始痰标本，18例患者出现了分枝杆菌持续培养阳性(报阳间隔N3个月且

培养分离菌株N3株)，转阴较慢的情况。收集这18例持续培养阳性患者2018

-2023年间所有培养分离菌株共83株。本研究收集的菌株及痰标本经过深圳市

第三人民医院伦理委员会批准（伦理编号:深圳三院伦审械字［2022-074-02］）,

患者均签署知情同意书。

（二）菌株保藏与复苏

2022年6月至2023年12月培养阳性MTB分离株于37°C培养箱结核菌生长

指示管（MycobacteriaGrowthIdicatorTube,MGIT）液体培养管中持续增

菌保藏。2022年6月前菌株冻存于医院检验科结核室菌种库中，需复苏后进行

后续研究。复苏步骤为：将冻存的菌液从冰箱取出解冻，用吸管在生物安全柜里

吹吸混匀后取500ul接种至新MGIT管中放入BD960培养，并取3〜4滴接种至罗

氏中性固体培养基上，37°C