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基于报告找到调节CRISPR-CAS9系统对组进行精准

编辑的小分子化合物方法的简单介绍

——药物化学生物学平时作业

药学122

今天我所要给大家介绍的是一种基于报告的筛选方法。它试图找到能够通过同源指

导修复调节CRISPR-CAS9系统对组进行精准编辑的小分子化合物。今天重点介绍下报告

和CRISPR-CAS9系统。我选择的文献是来自CELLSTEMCELL期刊2015年2约5日，

《SmallMoleculesEnhanceCRISPRGenomeEditinginPluripotentStemCells》（小分子增强多能

干细胞中的CRISPR组编辑）。该期刊的影响因子为22.151，参见JCR，SCI分区为大类

学科：生物1区；小类学科：细胞生物学1区、细胞与组织工程1区，参见于LetPub。

如何查找英文文献，首先要选择合适的数据库进行检索例如ACS，WEBOFSCIENCE等，

输入恰当的例如targetidentification相较于我第一次使用的targetdiscovery好很多。

第二步是缩小检索范围，例如进一步在结果中有哪些信誉好的足球投注网站smallmolecule或筛选出bio和chem开

头的期刊排除其他领域；第三步是阅读标题和选择所需要的文献。

这篇文献主要介绍了一种基于报告的筛选方法，找到能够通过同源指导修复调节

CRISPR-CAS9系统对组进行精准编辑的小分子化合物。

首先，先介绍一下CRISPR-CAS9系统，它是一种敲除的新方法，其工作原理是crRNA

通过碱基配对与反向活性RNA（tracrRNA）形成复合物，此复合物酶CAS9蛋白在

与crRNA配对的序列靶位点剪切双链。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具

有作用的sgRNA（shortguideRNA），足以Cas9对的定点切割。2013年

到组上的具体靶点，从而对特定位点进行切割导致突变。这是我从小木虫上找到的

关于CRISPR-CAS9编辑的基本流程：1.设计两条oligo序列：退火形成双链；2.将双

链连接到载体中；3.转化G10CompetentCell；筛选阳性克隆；验证序列；质粒大

提，电转染靶细胞；4.在细胞内crRNA识别靶位点，Cas9对靶位点进行随机剪切；5.Cruiser

酶切细胞池，计算突变率，Cruiser酶切初筛阳性克隆，将阳性克隆验证；做敲除序列对

比分析。

接下来介绍一下报告，报告(reportergene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶

的。关于荧光的报告最常见的是荧光素酶它是能够催化不同底物氧化发光的一类

酶。常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线

性范围宽达7～8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报告，用荧光比色计即可检测酶活

性，因而适用于高通量筛选。荧光素酶报告有许多优点：①非性；②比氯霉素乙酰

基转移酶（CAT）及其他报告速度快；③比CAT灵敏100倍；④由于半衰期短，故启动

子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积累。

本文献中使用荧光蛋白：绿色荧光蛋白(GFP）其发光机理比荧光素/荧光素酶要简

单得多。一种荧光素酶只能与相对应的一种荧光素合作来发光，而绿色荧光蛋白并不需要与

其他物质合作，只需要用蓝光照射，就能自己发光。GFP是一个由238个氨基酸残基组成的

蛋白，在蓝色到紫外线波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光（作用原理）。用395Bin的

紫