细胞培养的基本方法.pptVIP

使用前用75％酒精擦洗台面，并提前用紫外线灭菌30min。关闭紫外灯后应启动鼓风机运转几分钟后再进行培养操作；净化工作区不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰；用后工作台要用75％酒精擦洗，以备后面工作人员使用；经常注意工作区上方微压表的指示，及时更换滤器。取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。常用方法有机械法和化学法。六、培养细胞的取材第二节培养细胞的观察将组织剪成小块后，接种于培养瓶，24小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮细胞的生长。如需做组织染色或电镜检查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡01020304组织块培养法消化培养法采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。密度抑制（Densityinhibition）或接触抑制（Ccontactinhibition）1958年Abercrombie等学者提出的一种现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动即可停止。所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。培养细胞的生长过程原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间，因细胞种类不同，一般1-4周。传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。01一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisis）02有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。030102衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓慢，逐渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。表皮细胞寿命4-10天；红细胞3周-3个月，白细胞5-7天，神经细胞数年或更多。1实体显微镜（解剖镜）倒置显微镜生物显微镜照相设备2对培养材料进行细胞学鉴定和研究2、显微镜观察细胞计数法（cellcounting）01用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。02细胞生长曲线（cellgrowthcurve）01是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。02横坐标为培养时间03纵坐标为细胞密度04注意：只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合观察。05细胞生长曲线对数生长期缓慢生长期生长天数平衡期细胞数量第三章细胞培养的基

本方法第一节无菌操作技术第二节培养细胞的观察第三节细胞培养中常用的染色方法第四节细胞培养的污染和检测主要内容重点和难点：01掌握细胞培养中无菌操作技术及操作过程中需要注意哪些问题；02预防污染是无菌操作的关键。03教学目的和要求第一节无菌操作技术由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。一切操作需要保证无菌和有条不紊。组织培养中最重要的，也是最基本的要求就是各项操作均应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养基、器皿材料、接种工具、操作环境、培养室和超净工作台等各个环节都应注意。实验器具等的洗涤和材料的准备在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。培养玻璃器具的洗涤是非常重要的。用完后应洗净，再用蒸馏水冲一遍，烘干；01用合适的方法灭菌。02培养室和超净台的消毒无