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高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种PCR检测方法

1范围

本文件规定了高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种PCR检测的引物、仪器设备、试剂耗材、检测步骤、结果判定、防止交叉污染和废弃物处理的措施等。

本文件适用于高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株的PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

SN/T2102.1食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义

SC/T7014水生动物检疫实验技术规范

SC/T7015染疫水生动物无害化处理规程

SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种high-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae，PDD）是弧菌科发光杆菌属美人鱼发光杆菌（Photobacteriumdamselae）的一个亚种，广泛分布于全球海洋环境中，可以感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟、鲸豚类等不同的海洋动物。该菌种不同菌株因携带的毒力基因不同，对宿主呈现出高致病性、低致病性和无致病性。本文件界定的高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种是指感染宿主后能引起发病，最短可在1天内造成鱼类等宿主死亡并引发流行性疾病的菌株。

4PCR引物

4.1hlyB基因的特异引物

正向序列hlyB-F:5-ACTCGCTTACTTGAATCGGAAAT-3

反向序列hlyB-R:5-TCACGAAAGACATTGAGCATC-3

4.2dly基因的特异引物

正向序列dly-F:5-TTTGGACGAGCGGTCCATTT-3

反向序列dly-R:5-GGAGCCCAATCTTGACCAGG-3

5仪器设备和试剂耗材

5.1仪器设备

无菌操作台、台式离心机、恒温金属浴、PCR仪、漩涡振荡器、生物安全柜、微量移液器、核酸电泳仪、凝胶成像仪、高压灭菌锅等。

5.2试剂耗材

超纯水、2×PCRMix（含dNTP、Mg2+、DNA聚合酶）、SYBRGreenI染料、ROX参比染料、组织裂解液（含1%TritonX-100、2mMEDTA、20mMTris-HCl、0.2%SDS、20mM硫酸铵、1%甜菜碱）、琼脂糖（电泳级）、DNA分子量标准（DL2000Marker）等试剂。

离心管、研磨棒、移液枪头、PCR管等耗材。

6检测步骤

6.1待检样品的核酸模板制备

参照《SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术》和《SC/T7014水生动物检疫实验技术规范》的相关规定，检查待检病样的外观症状，并在无菌操作台中对主要病灶部位进行无菌取样。随后剪取0.1g~0.2g病灶部位的组织样品置于1.5mL离心管中，用研磨棒研磨，加入200μL组织裂解液和300μL灭菌的超纯水，充分振荡混合均匀后，置于恒温金属浴上37℃保持5min~10min，使组织充分裂解（也可采用具有同等DNA抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒）。随后，用离心机8000rpm离心2min，获取上清液，吸取10μL上清液至一个新的无菌离心管中，并加入90μL超纯水对上清液进行稀释，振荡混匀后即作为待检样品的DNA核酸模板。

6.2PCR反应体系的配置

分别在200μL的PCR反应管中制作两个独立的20μLPCR反应体系。

其中一个反应体系标记为体系A，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的hlyB基因正向序列引物2μL，10μM的hlyB基因反向序列引物2μL，制备好的DNA模板4μL，加无菌超纯水至总体积为20μL。

另一个反应体系标记为体系B，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的dly基因正向序列引物2μL，10μM的dly基因反向序列引物2μL，制备好的DNA模板4μL，加无菌超纯水至总体积为20μL。

分别在A、B两个反应体系中加入4μL6.1小节中制备好的DNA核酸模板，即完成PCR反应体系的配置。

阴性对照反应体系以等体积无菌超纯水替代DNA模版。

反应体系配置完成后，振荡均匀并瞬时离心后，迅速将反应管置于PCR仪中。

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