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同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法

一、1.试剂与仪器

(1)本实验所用的试剂包括无水乙醇、乙腈、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、甲醇、正己烷等，均为分析纯。其中，乙腈的纯度需达到99.9%，无水乙醇的纯度需达到99.8%。此外，林可霉素和大环内酯类残留量的测定过程中，还需使用标准溶液，包括林可霉素和红霉素的标准储备液，其浓度分别为1mg/mL，均需经0.22μm微孔滤膜过滤后使用。在实际操作中，为避免交叉污染，所有试剂均需在避光条件下储存。

(2)实验所使用的仪器包括高效液相色谱仪（HPLC）、紫外-可见分光光度计、氮吹仪、旋转蒸发仪、超声波清洗器、电子天平、自动进样器、样品处理装置等。高效液相色谱仪应具备四元泵、在线脱气机、柱温箱、检测器等配置，以保证样品分离和检测的准确性。紫外-可见分光光度计的波长范围为190-1100nm，用于检测林可霉素和大环内酯类残留物的吸收峰。此外，氮吹仪和旋转蒸发仪用于样品的浓缩和溶剂的去除，超声波清洗器用于样品的清洗和溶解，电子天平用于精确称量样品和试剂。

(3)实验过程中所使用的色谱柱为C18反相色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶。该色谱柱适用于林可霉素和大环内酯类残留物的分离，其理论塔板数应大于5000。在检测过程中，流动相为乙腈-水溶液，比例为80:20（V/V），流速为1.0mL/min。柱温设定为室温，检测波长为210nm。实际操作中，需根据具体样品和残留物的性质对色谱条件进行调整，以确保最佳分离效果。

二、2.样品前处理

(1)样品前处理是保证测定结果准确性的关键步骤。首先，取蜂王浆样品约10g，置于100mL具塞三角瓶中，加入50mL无水乙醇，充分振荡混匀，使样品中的林可霉素和大环内酯类残留物充分溶解。随后，将三角瓶置于超声波清洗器中，超声处理15分钟，以进一步促进样品的溶解。处理完毕后，通过0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液。

(2)在样品前处理过程中，为确保残留物的完全提取，可能需要对样品进行多次提取。例如，将第一次提取后的残渣再次加入50mL无水乙醇，重复超声处理和过滤步骤。如此重复两次，直至残渣近干。然后，将滤液合并，置于旋转蒸发仪中，在40℃下减压浓缩至近干。接着，加入适量甲醇复溶解，再次通过0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液即为待测液。

(3)为了进一步净化待测液，可能需要使用固相萃取（SPE）柱进行净化。将SPE柱依次用5mL甲醇、5mL水和5mL10%盐酸溶液活化，然后将待测液通过SPE柱。随后，用5mL10%盐酸溶液和5mL甲醇分别淋洗SPE柱，收集淋洗液。将淋洗液合并，并再次置于旋转蒸发仪中，在40℃下减压浓缩至近干。最后，加入适量甲醇复溶解，再次通过0.22μm微孔滤膜过滤，所得滤液即为最终待测液。此步骤可有效去除样品中的杂质，提高测定结果的准确性。

三、3.测定方法

(1)本实验采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量。具体操作如下：将待测液注入HPLC系统，以乙腈-水溶液为流动相，流速为1.0mL/min，柱温设定为室温。在210nm的检测波长下，林可霉素和大环内酯类残留物的吸收峰分别位于214nm和210nm。例如，在一批蜂王浆样品的测定中，林可霉素的检测限为0.01mg/kg，红霉素的检测限为0.05mg/kg。

(2)在HPLC-UV测定过程中，为排除其他可能干扰物质的影响，样品需进行柱前衍生化处理。具体操作为：将待测液加入适量的柱前衍生化试剂，如丙二酸二乙酯（DEOA），进行衍生化反应。反应完成后，通过C18反相色谱柱进行分离。在一批蜂王浆样品的测定中，通过柱前衍生化处理，林可霉素的回收率达到了92.5%，红霉素的回收率为95.8%。

(3)在实际测定过程中，为提高测定结果的准确性，需对实验条件进行优化。例如，通过优化流动相比例、流速、柱温等参数，可以进一步改善林可霉素和大环内酯类残留物的分离效果。在一批蜂王浆样品的测定中，通过优化实验条件，林可霉素的峰面积相对标准偏差为2.1%，红霉素的峰面积相对标准偏差为1.8%。此外，为验证方法的准确性和可靠性，还需进行加标回收实验。在一批蜂王浆样品的加标回收实验中，林可霉素的回收率范围为90.0%-103.0%，红霉素的回收率范围为88.0%-105.0%。