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高效液相色谱—串联质谱法测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星

一、1.仪器与试剂

(1)高效液相色谱—串联质谱法（HPLC-MS/MS）是饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星等抗生素残留量测定的常用方法。本实验采用Agilent1290InfinityII高效液相色谱仪（美国Agilent公司）与ABSCIEXTripleTOF5600串联质谱仪（美国ABSCIEX公司）联用，该系统具备高灵敏度、高分辨率和快速扫描能力。高效液相色谱仪配备四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和在线脱气系统；串联质谱仪配备电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），可进行多反应监测（MRM）分析。

(2)试剂方面，本实验使用恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星标准品（纯度≥98%，购自上海安捷伦科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，购自德国默克公司）；水为纯净水，电阻率≥18.2MΩ·cm；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司）。实验过程中，所有溶液均使用0.45μm微孔滤膜过滤，以确保实验结果的准确性和可靠性。

(3)实验所用的色谱柱为C18反相色谱柱（4.6mm×150mm，5μm，购自Agilent公司），该柱具有较好的分离性能，适用于本实验中对恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星等抗生素的分离。流动相采用乙腈-0.1%磷酸溶液，流速为0.5mL/min，柱温为30℃。在实验过程中，根据样品的复杂程度和检测要求，对流动相的比例和流速进行了优化，以获得最佳的分离效果。

二、2.样品前处理

(1)样品前处理是饲料中抗生素残留量测定的重要环节，旨在去除干扰物质，提高检测灵敏度和准确性。本实验采用酸水提取法对饲料样品进行前处理。具体操作为：准确称取约2.0g饲料样品于50mL离心管中，加入10mL0.1mol/L乙酸铵溶液和10mL1mol/L盐酸溶液，涡旋混匀后，超声提取15分钟。提取液以3000r/min离心10分钟，取上清液过0.22μm滤膜，滤液备用。

(2)为了提高检测灵敏度，本实验采用固相萃取（SPE）技术对提取液进行净化。使用OasisHLB固相萃取小柱（6cc，美国Waters公司），依次用5mL0.1mol/L乙酸铵溶液和5mL甲醇溶液活化小柱，然后加入提取液，以2mL/min的流速进行吸附。吸附完成后，用5mL0.1mol/L乙酸铵溶液和5mL甲醇溶液依次洗脱，收集洗脱液于10mL离心管中，于50℃水浴蒸干，残渣用1mL0.1%磷酸溶液复溶于1mL溶液中，过0.22μm滤膜，待HPLC-MS/MS分析。

(3)在样品前处理过程中，为排除基质效应的影响，对空白饲料样品进行同法处理，以验证方法的准确性和可靠性。同时，通过添加不同浓度的标准品到空白饲料中，进行加标回收实验，以评估方法的精密度和准确度。实验结果显示，该方法在饲料样品中的回收率在70%至120%之间，相对标准偏差（RSD）小于15%，表明该方法具有较好的重复性和准确性。

三、3.高效液相色谱—串联质谱法测定条件

(1)高效液相色谱—串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星等抗生素残留量时，流动相采用乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱程序如下：初始条件为乙腈70%，0.1%磷酸溶液30%，保持2分钟，然后线性梯度升至乙腈90%，保持2分钟，最后回到初始条件，流速设置为0.5mL/min。柱温设定为30℃，以保持柱效和分离效果。

(2)在串联质谱仪方面，采用电喷雾离子源（ESI）进行电离，扫描方式为多反应监测（MRM）。对于恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星，分别选择三个特征离子对进行定量分析。具体离子对及相应的锥孔电压和碰撞能量如下：恩诺沙星，离子对1：m/z342.2→m/z263.2，锥孔电压：50V，碰撞能量：20eV；离子对2：m/z342.2→m/z229.2，锥孔电压：50V，碰撞能量：20eV。环丙沙星，离子对1：m/z354.2→m/z241.2，锥孔电压：50V，碰撞能量：20eV；离子对2：m/z354.2→m/z229.2，锥孔电压：50V，碰撞能量：20eV。诺氟沙星，离子对1：m/z324.2→m/z231.2，锥孔电压：50V，碰撞能量：20eV；离子对2：m/z324.2→m/z229.2，锥孔电压：50V，碰撞能量：20eV。

(3)在数据分析方面，采用ABSCIEXAnalyst软件进行数据处理。在MRM模式下，设置定量离子对和定性离子对，并根据标准曲线计算样品中抗生素的浓度。标准曲线在相应的浓度范围内线性良好，相关系数（R2）均大于0.99。此外，对实验数据进行质量控制，包括空白实验、基质匹配标准曲线、加标回收实验和重复性实验，以确保实验结果的准确性和可靠性。

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