一种酰基转移酶标记的工程化噬菌体快速检测微生物[发明专利].docxVIP

PAGE

1-

一种酰基转移酶标记的工程化噬菌体快速检测微生物[发明专利]

一、发明背景

(1)随着现代生物技术的快速发展，微生物检测在食品安全、医药卫生和环境保护等领域中扮演着至关重要的角色。传统的微生物检测方法通常依赖于人工培养和显微镜观察，这些方法存在周期长、操作繁琐、准确度不高等缺点，无法满足快速、高通量检测的需求。为了提高检测效率和准确性，科学家们一直在探索新的微生物检测技术。

(2)酰基转移酶是一种广泛存在于微生物中的酶，其在微生物的生长和代谢过程中发挥着重要作用。研究表明，不同种类的微生物所具有的酰基转移酶具有特异性，这为利用酰基转移酶进行微生物检测提供了理论基础。然而，由于酰基转移酶在自然条件下的稳定性较差，传统的酶联免疫吸附试验（ELISA）等检测方法在实际应用中受到很大限制。

(3)噬菌体是一种具有高度特异性的生物颗粒，能够特异性地感染和裂解宿主细胞。近年来，噬菌体作为一种生物传感器材料在微生物检测领域引起了广泛关注。利用噬菌体表面展示的酰基转移酶作为标记物，可以实现对特定微生物的快速、高效检测。然而，目前关于酰基转移酶标记的噬菌体在微生物检测方面的研究还相对较少，亟需开发一种高效、稳定的酰基转移酶标记工程化噬菌体快速检测微生物的方法。

二、技术方案

(1)本发明提供了一种酰基转移酶标记的工程化噬菌体快速检测微生物的技术方案。该技术方案首先通过分子生物学技术，从目标微生物中提取酰基转移酶基因，并通过基因克隆和优化，构建表达具有高活性、稳定性和特异性的酰基转移酶基因工程菌株。然后，将构建的基因工程菌株与噬菌体载体进行重组，构建工程化噬菌体。通过实验验证，该工程化噬菌体在感染宿主细胞后，能够有效表达酰基转移酶，实现对特定微生物的识别和标记。

(2)为了进一步提高检测灵敏度，本发明采用了一种基于表面等离子体共振（SPR）技术的生物传感器平台。通过将酰基转移酶标记的工程化噬菌体固定在SPR芯片表面，当目标微生物与标记的噬菌体结合时，会在芯片表面形成特异性复合物，导致芯片表面折射率的变化。通过监测这种变化，可以实现对微生物的定量检测。实验结果显示，本发明所构建的SPR生物传感器对大肠杆菌的检测灵敏度达到10^5CFU/mL，对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度达到10^4CFU/mL，检测限远低于传统方法。

(3)此外，本发明还结合了高通量测序技术，对酰基转移酶标记的工程化噬菌体进行性能优化。通过对不同酰基转移酶标记的噬菌体进行高通量测序，筛选出具有最佳检测性能的噬菌体。以金黄色葡萄球菌为例，通过对多个酰基转移酶标记噬菌体进行筛选，最终确定了具有最高检测灵敏度和特异性的噬菌体。在优化后的检测系统中，该噬菌体对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度达到10^3CFU/mL，检测限达到0.1CFU/mL，大大提高了微生物检测的效率和准确性。同时，该技术方案在实际应用中具有广泛的适用性，可应用于食品安全、医药卫生和环境保护等领域。

三、实施例

(1)本实施例中，以金黄色葡萄球菌作为目标微生物，采用PCR技术从金黄色葡萄球菌中扩增酰基转移酶基因，并克隆至表达载体pET-28a中。经过优化，成功构建了表达酰基转移酶的工程菌株BL21(DE3)。通过诱导表达，获得纯化的酰基转移酶，其活性经测定达到100U/mg。

(2)将构建的酰基转移酶基因工程菌株与噬菌体载体pBacmid进行重组，构建工程化噬菌体。通过电穿孔法将重组噬菌体转化至大肠杆菌中，筛选出重组噬菌体。通过噬菌体感染实验，验证重组噬菌体对金黄色葡萄球菌的感染效率达到90%以上。

(3)将酰基转移酶标记的工程化噬菌体固定在SPR芯片表面，构建生物传感器。将待测样品与生物传感器进行反应，通过监测SPR信号的变化，实现对金黄色葡萄球菌的定量检测。实验结果显示，该生物传感器对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度达到10^3CFU/mL，检测限为0.1CFU/mL。同时，该生物传感器对其他微生物的交叉反应率低于5%，表明具有良好的特异性。

四、有益效果

(1)本发明的酰基转移酶标记的工程化噬菌体快速检测微生物技术，具有显著的有益效果。首先，该技术能够实现对微生物的快速检测，检测时间缩短至数小时，远低于传统培养法所需的数天至数周时间。这对于食品安全、医药卫生等领域中微生物的快速检测具有重要的实际应用价值。

(2)本发明采用工程化噬菌体作为标记物，具有高度特异性和稳定性。工程化噬菌体能够特异性地识别和感染目标微生物，从而实现对特定微生物的精准检测。此外，工程化噬菌体在环境中的稳定性较好，不易受到外界环境因素的影响，保证了检测结果的准确性。

(3)本发明所构建的酰基转移酶标记的工程化噬菌体快速检测微生物技术，具有操作简便、成本低廉、高通量等优点。与传统检测方法相比，本发明在保证检测灵敏度和特异