微生物限度检查法—乌鸡白凤丸的微生物限度检查（药品生物检定）.pptx

乌鸡白凤丸的微生物限度检查

;一、药品微生物限度检查

1、几个名词解释

（1）微生物的概念

所谓微生物是一群个体微小、结构简单肉眼不能直接看到，必须借助显微镜以及其它手段才能辨别的微小生物。

（2）菌落

一般是指在固体培养基上，由细菌单细胞经过适宜温度培养在一个局部位置上，繁殖而成的可见菌体细胞群。

（3）无菌技术

无菌技术主要指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施，无菌实验器材以及无菌操作等统称为无菌技术。

;（4）消毒

消毒是指杀灭病因微生物的繁殖体，但杀不死芽孢等全部微生物。

常用的清毒剂的种类

75%乙醇、甲醛、碘酊、0.1%新洁尔灭、乳酸、过氧乙酸、3%来苏尔、过氧化氢等。

（5）灭菌

凡能杀灭物体中所有微生物繁殖体及芽孢或孢子的作用称为灭菌。

常用的灭菌方法

(5．1)干热灭菌法

(5．2)湿热灭菌法

;（6）微生物限度检查法定义

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵菌数及控制菌检查。

（6．1）操作环境

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净验证。

（6．2）培养温度和时间

本检查法中细菌培养温度为30~35oC；时间为48小时。霉菌、酵母菌培养温度为23~28oC；时间为72小时。控制菌培养温度为35~37oC；时间为48小时。

眼用制剂微生物限度检查用薄膜过滤法，培养时间为7天。;2、微生物限度检查方法学验证

（1）验证采用的方法：

①常规法

②稀释法

③离心沉淀集菌法

④薄膜过滤法

⑤中和法

⑥离心和培养基稀释法

⑦离心和薄膜过滤法

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（2???细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

（2．1）菌种

验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

（1）大肠埃希菌(CMCC(B)44102)

（2）金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)

（3）枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)

（4）白色念珠菌(CMCC(F)98001)

（5）黑曲霉(CMCC(F)98003);(2．2)菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂养基中，培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24-28小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m1含菌数为50-100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5-7天，加入3-5m10.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m1含孢子数50~100cfu的孢子悬液

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（2．3）验证方法

验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

首先应进行预试验，做金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率，然后再确定验证方法。

（1）试验组平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1m1和50-100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50-100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。

（2）菌液组测定所加的试验菌数

（3）供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数法测定供试品本底菌数。

（4）稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液代替供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1m1供试液含50