mRNA疫苗体外转录系统的构建.pdf

摘要

每年数以百万计的人因为接种疫苗而避免感染传染病，挽救的生命不计其数。然而，

灭活病毒疫苗和减毒活疫苗等传统疫苗由于开发耗时较长，无法适应突然爆发的大流行

性传染病。随着新冠肺炎疫情的全球爆发，该病毒持续快速的进化和变异，在短短三年

的时间中不断产生具有更强传染性和毒力的突变株；针对这种新出现的全球大流行的疫

苗的快速开发变得越来越重要。

近年来，mRNA疫苗由于其具有快速研发和大规模生产等优势，在对抗新出现的传

染病方面引起了全世界科研人员极大的兴趣。同时，它们的发展仍面临许多障碍，例如

它们的安全性、细胞传递、吸收以及对制造、物流和存储的响应。mRNA疫苗的工业生

产主要分为上游生产、下游纯化以及包装三大步骤。上游生产重要是从含有目的基因的

质粒中体外转录出mRNA；然后通过下游纯化的多种步骤将mRNA分离纯化，去除体

外转录反应后混合物中的各类杂质；最终包装到各类递送系统中高效地穿透细胞膜，提

高mRNA疫苗的效率。整个生产过程相关的酶通过常规的纯化手段不易获得，相关制

剂的价格较为昂贵，制约着国内的研究，也对国内医药公司低成本、高效率地大规模生

产mRNA疫苗有一定的阻碍。

本论文主要关注mRNA上游生产相关的几种关键酶。我们首先选择了限制性内切

SapⅠDNA3

酶，该酶线性化质粒得到的模板’端是平末端，能够有效的降低体外转录

使产生的副产物。我们将SapⅠ基因与EGFP-Sumo序列融合表达，在提高限制性内切酶

的产量的同时改善其可溶性。同时构建了SapⅠ相应的甲基转移酶原核表达质粒，最终成

功表达纯化限制性内切酶SapⅠ。然后我们通过质粒双酶切反应验证得到的SapⅠ活性，发

现我们纯化得到的酶具有较高的活性，活力约为600U/μl。

接下来我们将野生型T7RNA聚合酶与高温神袍菌的lacI样蛋白的DNA结合结构

域融合表达，纯化得到了耐高温的T7RNA聚合酶，通过体外转录mRNA验证了酶活，

发现我们的T7RNA聚合酶相较于国外产品有着较高的活性，在高温反应中特异性更强。

整个上游生产步骤中最关键的酶就是5’Cap加帽相关的酶，主要是Cap0到Cap1

2-O

加帽酶和’甲基转移酶。这两种酶运用普通的大肠杆菌表达系统纯化时，都存在于

包涵体内，不易于纯化。我们将它们与Sumo标签蛋白融合表达，并使用pColdⅡ冷休

克表达载体系统提高其可溶性，最终成功表达纯化得到了Faustovirus加帽酶和2’-O甲

I

基转移酶。我们体外转录了带有GFP序列的mRNA，并用这两个酶进行加帽反应，转

染到LX293细胞中，测试发现我们的酶具有较强的活性。

综上所述，我们成功构建了mRNA疫苗上游生产相关的酶系统，表达纯化的系列

酶均具有较强的活性，并能够成功进行体外转录实验。

关键词：mRNA疫苗，体外转录，蛋白纯化

II

ABSTRACT

Everyyear,millionsofpeopleavoidinfectiousdiseasesbecauseofvaccination,savingcountlesslives.

However,traditionalvaccinessuchasinactivatedvirusandliveattenuatedvaccinecannotadapttothe

suddenoutbreakofpandemicinfectiousdiseasesduetothelongdevelopmenttime.Withtheglobal

outbreakofCOVID-19,theviruscontinuedtoevolveandmutaterapidly,andinjustthreeyears,mutations

withstrongerinfectivityandvirulencewereproducedcontinuously;Therapiddevelopment