免疫毒性试验方法.docx

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附件5

免疫毒性试验方法（征求意见稿）

Immunotoxicitytest

1范围

本方法规定了免疫毒性试验的基本原则、要求和方法。

本方法适用于化妆品原料的免疫毒性检测。

2试验目的

该检测方法用于评价化妆品原料免疫毒性反应的潜在可能性。

3定义

3.1免疫毒性immunotoxicity

受试物引起机体免疫抑制或增强、过敏反应或自身免疫反应。

3.2体液免疫humoralimmunity

抗原进入机体后，刺激B细胞产生效应B细胞和记忆细胞，进而产生抗体，与相应的抗原产生免疫反应。

3.3细胞免疫cell-mediatedimmunity

又称细胞介导免疫。狭义的细胞免疫仅指T细胞介导的免疫应答，即T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为致敏T细胞，对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用。T细胞介导的免疫应答的特征是出现以单核细胞浸润为主的炎症反应和/或特异性的细胞毒性。广义的细胞免疫还包括原始的吞噬作用以及NK细胞介导的细胞毒作用。

4试验的基本原则

本方法中的免疫毒性试验，用于评价受试物是否改变或损伤免疫系统的机能状态。免疫毒性试验分层级开展，初始筛选免疫毒性试验是在重复剂量毒性试验免疫毒性相关检查基础上增加淋巴细胞亚群分布、免疫球蛋白含量测定等项目。初始筛选试验结果出现明显异常，则需开展附加免疫毒性试验。

附加免疫毒性试验时，不同组的动物给予不同剂量的受试物至少30d，每天对动物进行观察，记录所出现的任何临床毒性表现。染毒结束后，处死动物，对相应的评价指标进行检测或分析；其中有些试验中需要用抗原将动物致敏。

5初始筛选免疫毒性试验

5.1初始筛选试验方法

采用初始筛选免疫毒性试验，对受试物潜在免疫毒性进行初步评估。初始筛选试验可整合至重复剂量毒性试验中。为发现免疫毒性指征，在重复剂量毒性试验中需评价以下指标：

（1）血液学检查：白细胞总数及分类计数等。

（2）血液生化检查：球蛋白、白蛋白/球蛋白比值。

（3）大体病理学：淋巴器官/组织。

（4）脏器重量：胸腺、脾脏、肾上腺的湿重（取出后应尽快称量，以免脏器失重），必要时可选代表性淋巴结进行称重。

（5）组织病理学检查：胸腺、脾脏、骨髓（股骨、胸骨或肋软骨部位的骨髓）、有代表性的淋巴结（黏膜附近或周围淋巴结）、所有肉眼可见的损伤。

此外，初始筛选试验还应在染毒结束时增加以下两个指标：

（1）免疫球蛋白分类（IgG、IgM、IgA和IgE）水平测定。

（2）淋巴细胞亚群测定：该试验属于免疫表型分析，目的是对淋巴细胞亚型进行鉴定和计数，通常采用流式细胞仪测试。对全血、外周血或从淋巴组织分离的免疫细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞等进行计数；检测免疫细胞表面标志物的改变，评估CD4+和CD8+T淋巴细胞或其它亚群的数量及比值。

5.2结果的处理

可通过表格形式总结试验结果。对于计数资料，表格应显示试验开始时各组动物数、出现免疫毒性反应的动物数、免疫毒性损伤的类型和每种损伤的动物百分比；对于计量资料，一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

5.3试验结果的评价

初始筛选试验结果，应基于淋巴细胞亚群分布、免疫球蛋白分类的结果，并考虑重复剂量毒性试验中的免疫毒性相关检查，如血液学、血清免疫球蛋白含量、免疫器官重量、组织病理学（胸腺、脾、淋巴结）等结果进行综合评价。上述检查项目出现异常时，即受试物各剂量组与溶剂对照组比较存在统计学上的显著差异（但应考虑动物正常的参考范围和变化），提示受试物存在潜在免疫毒性风险，应开展附加免疫毒性试验研究，以验证受试物潜在的免疫毒性，并明确免疫细胞和免疫功能受影响的程度。

6附加免疫毒性试验

附加免疫毒性试验包括：体液免疫、特异性细胞免疫、巨噬细胞检测、NK细胞活性四个方面，每个方面至少应选择一种方法进行。

6.1体液免疫试验

染毒后用抗原免疫动物，采用抗体形成细胞试验（也称溶血空斑试验）方法或酶联免疫吸附（ELISA）检测抗体滴度的方法评价受试物对体液免疫的影响。

6.1.1抗体形成细胞试验（AntibodyPlagueFormingCell，PFC）

受试物

固体受试物应溶解或悬浮于合适的溶剂中，临用前稀释至适当浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或临用前稀释至适当浓度。