3.1 重组DNA技术的基本工具（解析版）.docx

第三章基因工程

第1节重组DNA技术的基本工具

（课前+课中+课后，三案一体）

课前案

【预习新知】

一、基因工程的概念

二、基因工程操作的基本工具

1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀”

2.DNA连接酶——“分子缝合针”

3.载体——“分子运输车”

三、DNA的粗提取与鉴定实验

1.实验原理

（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。

（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。

（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。

2.实验步骤

（1）称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。

（2）在漏斗上垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。

（3）在上清液中加入体积相等的、预冷的95%酒精溶液，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或在1000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物晾干。

（4）DNA的鉴定：取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。

【预习自测】

1.限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。（√）

2.限制酶只能用于切割目的基因。（X）

3.限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。（√）

4.将制备的含有DNA的滤液加入预冷的95%酒精溶液，静置2-3min，可以将DNA析出。（√）

5.在DNA的粗提取与鉴定实验中，将丝状物溶解在2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。（X）

第1节重组DNA技术的基本工具课中案

【导】

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭，当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。

DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？

科学家用到了限制酶、DNA连接酶、载体等“分子工具”。限制酶能识別双链DNA分子的特定核苷酸序列，并将DNA双链切断，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA连接酶催化磷酸二酯键的形成，即催化一个DNA片段3端的羟基与另ー个DNA片段5端的磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键。载体上可以插入外源基因，它能携带该基因进入受体细胞，并在受体细胞中进行自我复制，或者整合到受体DNA上，随着受体DNA同步复制。载体一般还带有标记基因，以便进行重组DNA分子的筛选。

【思】

1.重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？

2.基因工程载体需要具备什么条件？

【议】

1.你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。

2.DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？

不是一回事。虽然DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成的酶，但两者存在显著的区别。

(1)DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是催化单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。

(2)DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，它不需要模板。

此外，两者虽然都是蛋白质，但它们的组成和性质各不相同。

3.阅读课本73页思考讨论“重组DNA分子”的资料，，剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？

剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。

4.质粒作为载体应该具备的条件有哪些？具备这些条件有什么意义？

①有一个或多个限制酶切割位点，便于外源基因插入；②有自我复制能力或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制的能力；③含有标记基因，以便筛选；