牛角膜浑浊度和渗透性试验.docx

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附件2

牛角膜浑浊度和渗透性试验（征求意见稿）

BovineCornealOpacityandPermeability(BCOP)Assay

1范围

本方法规定了牛角膜浑浊度和渗透性试验的基本原则、要求和方法。

本方法适用于化妆品原料的潜在不可逆眼损伤和无刺激性的评价，适用于单一物质及混合物。

2试验目的

本试验通过定量测定牛角膜浑浊度和渗透性的变化，以评价化学品原料对眼角膜的不可逆眼损伤程度。

3定义

3.1眼睛刺激性EyeIrritation

眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。

3.2不可逆眼损伤IrreversibleEyeDamage

眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。

3.3角膜的浑浊度CornealOpacity

角膜暴露于受试物后通透性改变的程度，角膜浑浊度增加表明角膜受损。

3.4角膜的渗透性CornealPermeability

测定通过角膜细胞层的荧光素钠染料的量来代表角膜上皮损伤的指标。

4试验原理

牛角膜浑浊度和渗透性试验是牛角膜接触化妆品原料后，通过测定角膜浑浊度和渗透性的变化来评估化学品原料的眼刺激程度。

5试剂和材料

5.1培养液

MEM培养液

MEM培养液（含酚红）

5.2Hanks’溶液

称取氯化钙140mg、六水合氯化镁100mg、七水合硫酸镁100mg、氯化钾400mg、磷酸二氢钾60mg、碳酸氢钠350mg、氯化钠8g、磷酸氢二钠48mg、葡萄糖1g，加水至1L。临用新配。

5.3荧光素钠溶液

液体受试物和固体受试物分别选用浓度为4mg/mL和5mg/mL的荧光素钠溶液进行渗透性试验。

5.4阳性对照

N，N-二甲基甲酰胺作为液体受试物的阳性对照，20%咪唑溶液作为固体受试物的阳性对照。

5.5阴性对照物

0.9%氯化钠溶液

5.6牛眼

大于6月龄的牛眼，直径为1.8cm~2.5cm。

牛眼放在2℃~4℃的Hanks’溶液中的使用时间为24h内。

5.7浑浊度仪及角膜夹持器（见附录A）

浑浊度仪是用来测量浑浊度的装置。根据浑浊度仪的光源不同，分为白光光源的浑浊度仪和单色光源的浑浊度仪。不同光源，体外刺激分的计算公式不同。

角膜夹持器由前室和后室两部分组成，前后室的内部直径均为1.7cm，深度2.2cm。

6试验步骤

6.1牛角膜的制备

剔除浑浊、有划痕、白斑、新生血管形成的牛眼。取无缺陷的牛眼，沿巩膜边缘2mm~3mm剪取并剥离角膜，角膜内皮层向上，置于Hanks’溶液中。

6.2角膜安装

角膜内皮层向下对准O型环放置在夹持器的后室上，再将前室盖在角膜上，前后室组合，旋紧。

6.3角膜平衡

按先后室再前室的顺序，将32℃预热的MEM培养液加满夹持器的前后室，确保没有气泡，将固定好的角膜夹持器垂直放置于32±1℃恒温设备中平衡1h。

6.4基准浑浊度的测定

角膜平衡后，按先前室再后室的顺序，吸出前后室培养液，重新加入预热的MEM培养液。浑浊度仪测定并记录每个角膜的浑浊度值，作为基准浑浊度。白光光度仪测定浑浊度小于7的角膜、单色光浑浊度仪测定值介于1200lux到1850lux之间的角膜为合格角膜。

6.5角膜的分组

取基准浑浊度符合要求的牛角膜，每次试验设受试物组、阳性对照组和阴性对照组，每组至少3只角膜。

6.6受试物暴露

受试物暴露方式有两种，一种针对液体和表面活性剂（固体或液体），另一种针对非表面活性剂固体。

液体和表面活性剂以原液给样；半固体、乳霜和蜡通常按液体测试；纯表面活性剂以配制成浓度为10%液体测试。暴露时间为10min。

非表面活性剂固体以配制成浓度为20%溶液或混悬液给样，暴露时间为4h。

溶剂首选0.9%氯化钠溶液，也可根据受试物的性质选择蒸馏水或其他可证明对测试系统无影响的溶剂。

受试物根据物化性质给样方式有两种，一种直接给样法用于非粘性到微粘性的液体化学品，另一种开窗法适用于半粘性和粘性液体化学品以及纯固体。确保测试化学品充分覆盖上皮表面，并在冲洗步骤中充分去除。

直接给样：取分组后带有角膜的夹持器，吸去前室液体，加入750μL受试物于前室中，全部加样后，确保样品覆盖整个角膜，角膜内皮层朝下水平放置于32±1℃恒温设备中。

开窗给样：用开窗器移除前室的玻璃片，夹持器前室在上，水平放置。用棉球轻轻吸干角膜上残存培养液，取750μL受试物均匀平铺在角膜上，置于32±1℃恒温设备，暴露时间为10min。

6.7暴露后浑浊度值测定

暴露结束后，吸出前室内的受试物，用MEM(含酚红)培养液将角膜冲洗三次，再用ME