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过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法[发明专利]

一、引言

(1)随着现代生活节奏的加快和环境污染的加剧，氧化应激已经成为许多慢性疾病发生发展的重要病理生理机制。氧化应激是指机体在氧化还原反应中产生的活性氧（ROS）过量积累，导致细胞和组织损伤的过程。猪脾细胞作为一种重要的免疫细胞，其氧化应激反应在机体免疫调节和疾病发生发展中具有重要作用。因此，建立一种稳定可靠的猪脾细胞氧化应激模型对于深入研究氧化应激在疾病发生发展中的作用机制具有重要意义。

(2)过氧化氢（H?O?）作为一种常用的氧化剂，能够模拟体内氧化应激环境，诱导细胞产生氧化应激反应。本研究旨在利用过氧化氢诱导建立猪脾细胞氧化应激模型，通过观察细胞形态学变化、检测细胞内活性氧（ROS）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量等指标，探讨过氧化氢诱导猪脾细胞氧化应激的机制，为后续研究氧化应激与疾病的关系提供实验基础。

(3)目前，关于猪脾细胞氧化应激模型的建立方法研究较少，且存在一定程度的局限性。本研究拟采用不同浓度过氧化氢处理猪脾细胞，通过比较不同浓度处理组细胞氧化应激指标的差异，确定最佳诱导浓度。同时，本研究还将结合分子生物学技术，如基因沉默和过表达等方法，进一步探讨氧化应激相关信号通路在猪脾细胞氧化应激过程中的作用。通过对猪脾细胞氧化应激模型的深入研究，有望为临床疾病的治疗提供新的思路和方法。

二、实验材料与方法

(1)实验材料包括：猪脾细胞来源于健康猪的脾脏组织，采用组织块培养法进行原代培养，经过3代传代后用于实验。实验试剂包括：过氧化氢（H?O?）、活性氧（ROS）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒、RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、DMSO等。实验仪器包括：CO?培养箱、倒置显微镜、酶标仪、低温高速离心机、分光光度计、超净工作台等。

(2)实验方法：首先，将猪脾细胞以1×10?细胞/孔的密度接种于6孔板中，在37℃、5%CO?的培养箱中培养24小时，使细胞贴壁。然后，将细胞分为对照组和实验组，实验组分别用不同浓度的过氧化氢（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L）处理，对照组只用培养基处理。处理时间为2小时，处理后用PBS缓冲液洗涤细胞3次。接下来，采用活性氧（ROS）检测试剂盒检测细胞内ROS水平，SOD活性检测试剂盒检测SOD活性，MDA含量检测试剂盒检测MDA含量。同时，通过Westernblot检测细胞内氧化应激相关蛋白的表达水平，如p47phox、p66shc等。

(3)具体操作如下：首先，按照试剂盒说明书进行ROS检测，取适量细胞裂解液加入荧光染料，混匀后于酶标仪检测激发波长为485nm、发射波长为530nm处的吸光度值。然后，按照SOD活性检测试剂盒说明书进行SOD活性检测，将细胞裂解液加入反应体系中，于酶标仪检测吸光度值。接着，按照MDA含量检测试剂盒说明书进行MDA含量检测，将细胞裂解液加入反应体系中，于酶标仪检测吸光度值。最后，进行Westernblot检测，将细胞裂解液加入蛋白裂解液中，进行蛋白提取和定量，然后进行SDS电泳，转膜，封闭，一抗和二抗孵育，最后进行化学发光检测。通过比较不同浓度过氧化氢处理组和对照组的ROS水平、SOD活性、MDA含量和氧化应激相关蛋白表达水平，分析过氧化氢诱导猪脾细胞氧化应激的浓度效应和机制。实验重复3次，取平均值进行统计分析。

三、实验结果与分析

(1)实验结果显示，随着过氧化氢浓度的增加，猪脾细胞内ROS水平逐渐升高，对照组的ROS水平为（0.32±0.05）μM，0.1mmol/L过氧化氢处理组的ROS水平为（1.23±0.15）μM，0.2mmol/L过氧化氢处理组的ROS水平为（2.45±0.20）μM，0.3mmol/L过氧化氢处理组的ROS水平为（3.56±0.25）μM，0.4mmol/L过氧化氢处理组的ROS水平为（4.78±0.35）μM，0.5mmol/L过氧化氢处理组的ROS水平为（5.92±0.40）μM。结果表明，过氧化氢能够有效诱导猪脾细胞内ROS水平升高。

(2)通过检测SOD活性和MDA含量，我们发现随着过氧化氢浓度的增加，猪脾细胞的SOD活性呈现下降趋势，而MDA含量呈现上升趋势。对照组的SOD活性为（120.3±5.2）U/mgprotein，0.1mmol/L过氧化氢处理组的SOD活性为（98.7±4.1）U/mgprotein，0.2mmol/L过氧化氢处理组的SOD活性为（78.5±3.8）U/mgprotein，0.3mmol/L过氧化氢处理组的SOD活性为（61.2±2.9）U/mgprotein，0.4mmol/L过氧