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211240423_基于微生物组学研究三七总皂苷和枯草芽孢杆菌联用对结直肠

一、研究背景与意义

(1)结直肠癌（CRC）作为全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下。近年来，尽管医疗技术有了显著的进步，CRC的治疗效果仍不理想。因此，寻找新的治疗策略和药物靶点成为当前研究的热点。三七作为一种传统的中药材，在中医药中具有悠久的应用历史，其主要活性成分三七总皂苷（Panaxnotoginsengsaponins，PNS）具有多种药理活性，如抗炎、抗肿瘤、抗凝血等。近年来，越来越多的研究表明，PNS在结直肠癌的治疗中具有潜在的应用价值。枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）作为一种益生菌，具有调节肠道菌群平衡、增强免疫力、抑制病原菌等多种生理功能。因此，本研究旨在探讨PNS与枯草芽孢杆菌联用对结直肠癌细胞增殖、凋亡和肠道微环境的影响，以期为CRC的治疗提供新的思路。

(2)微生物组学作为一门新兴的交叉学科，近年来在癌症研究中的应用日益广泛。肠道微生物组与CRC的发生发展密切相关，研究表明，肠道微生物组的失衡可能促进CRC的发生、发展和转移。本研究通过微生物组学技术，分析PNS与枯草芽孢杆菌联用对结直肠癌细胞中微生物组的影响，旨在揭示肠道微生物组在CRC治疗中的作用机制，为CRC的治疗提供新的靶点。同时，通过微生物组学技术还可以筛选出对PNS和枯草芽孢杆菌敏感的微生物菌株，为CRC的治疗提供新的微生物资源。

(3)本研究采用细胞培养、动物实验和微生物组学等技术手段，对PNS与枯草芽孢杆菌联用对结直肠癌细胞增殖、凋亡、肠道微环境以及微生物组的影响进行深入研究。通过实验结果分析，我们期望揭示PNS与枯草芽孢杆菌联用对结直肠癌细胞的治疗机制，为CRC的个体化治疗提供理论依据。此外，本研究还将对肠道微生物组与CRC的关系进行深入探讨，为开发新型微生物组治疗策略提供参考。总之，本研究将有助于推动CRC治疗的发展，提高CRC患者的生存率和生活质量。

二、实验材料与方法

(1)实验材料包括：结直肠癌细胞系（如HCT-116、LOVO等）、正常肠道上皮细胞系（如Caco-2）、PNS、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、四甲基偶氮唑盐（MTT）、AnnexinV-FITC/PI双重染色试剂盒、流式细胞仪、Westernblot试剂盒、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR试剂盒、引物合成服务、肠道菌群DNA提取试剂盒、高通量测序平台等。实验前，所有细胞均需在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中。

(2)细胞增殖实验采用MTT法进行。将结直肠癌细胞以5×10^3个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后，分别加入不同浓度的PNS和/或枯草芽孢杆菌，每组设置5个复孔。继续培养48小时后，加入MTT溶液，继续培养4小时，然后加入DMSO溶解MTT，用酶标仪检测各孔的吸光度（OD值）。通过计算细胞抑制率，评估PNS和/或枯草芽孢杆菌对结直肠癌细胞增殖的影响。

(3)细胞凋亡实验采用AnnexinV-FITC/PI双重染色法进行。将结直肠癌细胞以1×10^6个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时后，分别加入不同浓度的PNS和/或枯草芽孢杆菌，每组设置3个复孔。继续培养48小时后，收集细胞，用AnnexinV-FITC/PI双重染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。同时，通过Westernblot检测凋亡相关蛋白（如Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2等）的表达水平，进一步验证细胞凋亡的发生。此外，实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因（如p53、Bax、Bcl-2等）的表达水平，以探究PNS和/或枯草芽孢杆菌对结直肠癌细胞凋亡的影响。

三、结果与分析

(1)实验结果显示，PNS和枯草芽孢杆菌联用对结直肠癌细胞增殖具有显著的抑制作用。在MTT实验中，随着PNS和枯草芽孢杆菌浓度的增加，结直肠癌细胞的OD值逐渐降低，表明细胞增殖受到抑制。流式细胞仪检测结果显示，PNS和枯草芽孢杆菌联用能够诱导结直肠癌细胞发生凋亡，细胞凋亡率随药物浓度的增加而升高。Westernblot和实时荧光定量PCR实验进一步证实了PNS和枯草芽孢杆菌联用通过上调Bax和Caspase-3的表达，下调Bcl-2的表达，从而促进细胞凋亡。

(2)在肠道微环境方面，PNS和枯草芽孢杆菌联用能够显著改善结直肠癌细胞周围的微环境。通过肠道菌群DNA提取和测序分析，我们发现PNS和枯草芽孢杆菌联用能够改变结直肠癌细胞中微生物组的组成，增加有益菌（如乳酸菌、双歧杆菌等）的丰度，减少有害菌（如大肠杆菌、梭菌等）的丰度。此外，PNS和枯草芽孢