U6 snRNA qPCR说明书内容介绍.docxVIP

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介绍

产品简介

miRNA是动植物、病毒编码的由19-23个碱基组成的单链小RNA。成熟的miRNA会进入RNA诱导的沉默复合体（RISC）并且促使该复合体诱导mRNA的转录抑制或是特异靶mRNA的酶切降解。

U6snRNA在剪接体的装配以及催化mRNA剪接的过程中会经历主要的构象变化，它会结合特异蛋白Prp24p和一套7个LSm2p-8p蛋白来形成U6小核核糖核蛋白复合体。而该剪接复合体在真核细胞中参与mRNA前体的剪接。

U6snRNA荧光定量校正试剂盒是一种灵敏特异的方法，能够校正及对总RNA样品中各个miRNA做整体的表达分析。用户可以使用U6snRNA荧光定量校正试剂盒在不同的样品间将特定的microRNA相对于U6snRNA的表达比率标准化。

用本试剂盒进行荧光定量相对校正实验包括两步，U6snRNA逆转录反应和实时定量PCR反应。

相对定量的计算基础

microRNA表达的相对定量是由实验中得到的阈值循环数（Ct）计算而来。阈值循环数是指在这一个循环时，ΔRn出现具有统计学意义的增长并且第一次被检测到。这样，在PCR反应时，含有更高初始模板浓度的样品就会比低模板浓度的样品更早到达检测阈值，并得到一个更小的阈值循环数。

一次理想的microRNA定量实验中，PCR反应的每个循环中，产物都会成倍增长。因此阈值循环数每相差1个单位就等于2倍的初始模板浓度的差距。例如，如果Ct值增加了1个单位，那么初始模板浓度就减少一倍；如果Ct值减少一个单位，那么就说明初始模板浓度增加了一倍。因此这种属性被应用于计算目标基因和内参基因之间表达的相对定量值。更多信息请参照手册中数据分析部分。

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组分和保存

U6snRNA荧光定量校正试剂盒包括以下组分,按照所述条件短期贮存，长期贮存请全部置于-20℃,保质期3个月，如需要，可将dNTP、探针等试剂分装成小份，避免试剂反复冻融，若反复冻融可导致扩增效果不佳和保质期缩短等后果。

Reagent

Amount

Storage

50rxns

100rxns

200rxns

500rxns

5×RTbuffer

200μl

400μl

0.8ml

2×1ml

4℃

dNTP（10mM）

40μl

80μl

160μl

400μl

-20℃

MMLVReverseTranscriptase（200U/μl）

10μl

20μl

40μl

100μl

-20℃

2×Real-timePCRMasterMix1

0.5ml

1ml

2×1ml

5×1ml

4℃

U6snRNARTprimer（10μM）

10μl

20μl

40μl

100μl

4℃

U6snRNAspecificprimerSet（10μM）

20μl

40μl

80μl

200μl

4℃

miRNAspecificprobe（10μM）2

20μl

40μl

80μl

200μl

4℃

ROXreferencedye（50×)3

20μl/100μl

40μl/200μl

80μl/400μl

200μl/1ml

4℃

rTaqDNApolymerase（5U/μl）

10μl

20μl

40μl

100μl

-20℃

RNasefreeH2O

2×1.5ml

2×1.5ml

4×1.5ml

10×1.5ml

4℃

1.吉玛的专用的荧光定量PCR缓冲混合液，预混了反应所需的试剂，其中染料法试剂盒的MasterMix含有SYBRGreenI荧光染料，需要避光保存，而探针法试剂盒的MasterMix不含荧光染料，所以不需要避光保存；

2.U6snRNAspecificprobe（10μM）为探针法试剂盒专有的TaqMan探针。请务必将探针避光保存；

3.ROXReferenceDye是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差,需要使用低浓度ROXReferenceDye校正的仪器有AppliedBiosystems7000/7300/7500/7500Fast/7900Real-TimePCRSystem，配套ROX终浓度1×(0.4μl)；需要使用高浓度ROXReferenceDye校正的仪器有AppliedBiosys-temsStepOnePlusReal-TimePCRSystem和QuantStudio系列，配套ROX终浓度为5×(2μl)。其他品牌仪器