大口黑鲈易转食配合饲料相关SNPs挖掘及β半乳糖苷酶基因功能的初步研究.pdf

摘要

大口黑鲈（Micropterussalmoides），典型的肉食性鱼类，是我国重要的经济淡水养

殖鱼类。由于传统养殖过程中投喂冰鲜幼杂鱼对水体环境的污染以及生物饵料的紧缺，用

配合饲料全面代替冰鲜幼杂鱼已经成为必然趋势。新品种优鲈3号的生长性状和转食配合

饲料性状较优鲈1号得到了显著提升，为大口黑鲈养殖业的快速发展做出了重要贡献，但

目前生产上优鲈3号鱼苗转食配合饲料仍需经历“活饵-死饵-配合饲料”的过程。为进一

步缩短大口黑鲈鱼苗的转食时间、简化转食过程，本研究以优鲈3号为实验对象，首先在

鱼苗转食配合饲料过程中通过省略“死饵”的过渡步骤获得两个极端组（易转食组和不易

转食组），随后从两个极端组的简化基因组测序数据中挖掘易转食配合饲料性状相关分子

标记和功能基因，最后对候选基因β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）进行了初步功

能研究。主要内容如下：

1.大口黑鲈易转食配合饲料相关SNPs挖掘与验证

优鲈3号鱼苗养至20mm左右时开展极端转食配合饲料实验（直接从“活饵”到“配

合饲料”、省略“死饵”的过渡阶段），根据胃/体比值将鱼苗分别定义为易转食组、可

转食组和不易转食组。随机选取易转食组和不易转食组各15尾鱼苗的基因组DNA进行简

化基因组测序，共获得21.47Gcleandata，平均Q20和Q30分别为96.43%和90.53%。

SNPcalling和卡方检验初步挖掘到728个与转食配合饲料性状相关的候选SNPs（P

0.05），SnpEff注释得到5个候选基因。侧翼序列分析发现，候选SNPs中41个可被EcoRV、

HinfI、PstI、PvuII、XbaI和XhoI等限制性内切酶识别；成功设计的20对引物中，17对可

扩增得到单一条带，但最终仅8对可用PCR-RFLP技术进行分型。卡方检验或Fisher’s检

验结果发现，5个位点与转食配合饲料性状显著相关（P0.05），其中2个极显著相关

（P0.01）。同时，利用一般线性模型分析SNPs与大口黑鲈生长性状的相关性，发现2

个SNPs与生长性状显著相关（P0.05）。这些与相应性状相关的SNPs和基因可为大口

黑鲈新品种的选育提供分子参考。

2.大口黑鲈β-gal基因多态性与转食配合饲料性状关联分析

从大口黑鲈参考基因组调取β-gal基因的DNA序列，利用12对引物分段扩增和直接测序

的方法筛查该基因多态性，结果发现该基因8461bp中存在45个SNPs，共组成3组连锁位点

I

（分别命名为G804T、G1034A和A4174C）。利用自主开发的四引物分型技术对3组连锁位

点进行分型，发现分型结果与直接测序结果完全一致。卡方检验分析3组连锁位点与优鲈3

号鱼苗转食配合饲料性状的相关性，发现仅A4174C与转食配合饲料性状显著相关（P=

0.039）。进一步研究A4174C位点的等位基因在优鲈1号和优鲈3号群体中的频率分布，发

现等位基因C在优鲈1号和优鲈3号群体中依次升高（分别是0.531和0.922），进一步证实了此

位点与转食配合饲料性状的相关性。

3.大口黑鲈β-gal在鱼苗转食配合饲料过程中的初步功能研究

采用PCR扩增和直接测序技术验证大口黑鲈β-gal基因CDS序列，结果发现全长共1944bp，

编码647个氨基酸，CDS中共有12个SNPs位点，其中有4个错义突变位点。利用qRT-PCR检

测β-gal基因在不同组织中的相对表达量，发现在脑的表达量最高，其次是肾，在皮肤上相

对表达量最低。氨基酸序列构建的系统发育进化树结果表明，大口黑鲈野生和突变型β-gal

先聚为一支，随后与鲈形目、鲹形目、鲽形目、攀鲈目、鲤形目、海鲢总目和硬鳞总目聚

为一大簇，而鸟类、爬行类、两栖类和哺乳类则聚为另一大簇，两大簇均与玻璃海鞘

（Cionaintestinalis）、文昌鱼（Branchiostomabelcheri）、海七鳃鳗（Petromyzonmarinus）和

叶吻银鲛（Callorhinchusmilii）等亲缘关系相对较远。根据野生型和突变型个体的CDS区

域，去掉信号肽，设计特异性引物，构