细胞信号转导的技术方法.ppt

p38p38?p38?p38?p38p38?p38?p38?LPS、UV刺激心肌细胞共聚焦显微镜大体扫描LPS01.UV02.Control03.细胞信号分子的三维结构分析蛋白质三维结构分析对于揭示信号分子的功能的作用蛋白质与蛋白质相互作用的研究蛋白激酶结构域SH3KinaseBtkSrcSH3KinasePHSH2THSH21、蛋白质结合实验2、免疫共沉淀实验2、FRET和BRET与信号分子相互作用蛋白质分子的相互作用logo酵母双杂合系统IdentificationofMEF2Casasubstrateforp38FirstMilitaryMedicalUniversityFirstMilitaryMedicalUniversity细胞信号转导的技术方法蛋白激酶磷酸化及其活性测定蛋白激酶磷酸化的检测裂解培养的细胞获得裂解上清以免疫共沉淀法获得蛋白激酶SDS再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体以PhosphoAb-HRPWestern化学发光检测试剂盒测定蛋白激酶的磷酸化程度。加入该激酶底物和?32-ATP，激酶使底物磷酸化放射自显影，确定磷酸化条带以免疫共沉淀法获得蛋白激酶010203经典蛋白激酶活性分析实验流程以免疫共沉淀法获得蛋白激酶加入该激酶底物，激酶使底物磷酸化再加入底物磷酸化特异性抗体以PhosphoAb-HRPWestern化学发光检测试剂盒测定底物的磷酸化程度，进而推出蛋白激酶活性非放射性蛋白激酶活性分析实验流程0102无需接触放射性物质敏感度高：可以检测到每个磷酸化分子特异性：利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性分析信噪比高低背景系统完整：提供一整套直接从细胞裂解液中测试酶活的试剂节约时间：由几天降到几分钟较传统激酶活性测定方法的优点02468101214051020306090120Time(min)RelativekinaseactivityDynamicprocessesofp38activationbyLPSinRAWcellsEffectofindividualMAPKpathwaysonPRAKactivityinintactcellsMKK7(D)GST-ATF2GST-ELK1MKK1(E)MKK6(E)ControlHSP27PRAKControlAniso.ArseniteTNF-80kDa-47kDa-39kDa-80kDa-47kDakDa97.4-68.0-43.9-29.0-18.4-14.3-ControlAniso.ArseniteTNFABThemajorkinasesofp38?andp38P38MAPKinasePathway蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定PhosphopeptidemapofHSP27phosphorylatedbyPRAKinvitroChromatographyElectrophoresispH1.9+MAPKAPK2ChromatographyElectrophoresispH1.9+PRAKChromatographyElectrophoresispH1.9MIX+++++----+-HSP27p38?GST-PRAK(93A)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(186A)GST-PRAK(212A214A)GST-PRAK(182A)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(182D)GST-PRAK(182D212D)+-+-+-FoldofActivation05101520GST-PRAK(182A)GST-PRAK(182D)GST-PRAK(WT)GST-PRAK(93A)GST-PRAK(186A)GST-PRAK(182D212D)GST-PRAK(212A214A)BA++p38?-PRAK(182A)+p38?-PRAK(182D)p38?-PRAK(wt)T182istheregulatoryphosphorylationsiteofPRAK无活性诱变体DNA重组技术的应用结构与功能的研究活性诱变体PCRprimerPCRprimerJNK