重组蛋白表达体系.pptVIP

大肠杆菌表达系统缺陷酵母表达系统概述**缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等表达的蛋白多以包涵体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性酵母重组表达**大肠杆菌是首先成功表达外源基因的宿主菌，但不能表达结构复杂的蛋白质哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统能表达结构复杂的哺乳类细胞蛋白，但操作复杂，表达水平低酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化酵母表达系统在表达真核细胞外源蛋白时，既具有原核生物生长快、操作简便的特点，又具备哺乳类细胞翻译后加工和修饰的功能，从而表达有一定生物活性的外源蛋白酵母载体类型酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNAYep类（Yeastepisomalplasmid）附加体型Yrp类（Yeastreplicationplasmid）复制型Ycp类（yeastcentromericplasmid）：复制序列为ARS，并含有酵母染色体中心粒、端粒成分，稳定性好，但拷贝数只有一个，转化频率103-104/μgDNAYip类（yeastintegrativeplasmid）整合型:含有可与酵母染色体重组的序列，可以完全整合到染色体中。因此它依靠酵母染色体进行复制，具有很好的稳定性。拷贝数只一个，转化频率1-100/μgDNA酵母表达载体的分类**酵母表达载体附加体型载体在酵母宿主中的拷贝数量大，但在传代过程中易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量整合体型载体导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染色体基因组DNA整合，故稳定性高，但基因拷贝数低酵母载体由酵母2u质粒构建而来酵母表达载体的结构特点**酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒，包括来自酵母的部分基因序列和细菌的部分基因序列01其细菌部分主要包括可以在大肠杆菌中复制的复制起点序列（ori）和特定的抗生素抗性基因序列。能在大肠杆菌中克隆、且具有较高的拷贝数，这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增和筛选01其酵母部分包括与宿主互补的营养缺陷型基因序列或特定的抗生素抗性基因序列、编码特定蛋白基因的启动子和终止子序列01**外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝-高表达外源基因表达效率：启动子外源蛋白糖基化：酵母分泌的异源蛋白糖基化产物与天然产物完全相同宿主菌珠影响：菌体生长力强；菌体内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强影响酵母重组表达的因素酿酒酵母的优缺点**21优点：生长繁殖速度快，易培养，能高密度发酵，成本低，遗传操作方便，对外源蛋白能进行翻译后修饰和加工缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不稳定，表达质粒易于丢失等甲醇酵母的生物学特征：甲醇酵母表达系统**甲醇酵母能利用甲醇为其唯一碳源甲醇代谢第一步：甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化成甲醛调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用来调控异源蛋白质的表达在甲醇酵母中有两种乙醇氧化酶基因：AOX1和AOX2010302AOX1：细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力由AOX1提供。当细胞以甲醇为唯一碳源时，AOX1基因的表达被甲醇严格调控，并被诱导到很高的水平，此时细胞利用甲醇能力正常，在甲醇介质上生长较快，这种菌株称为Mut＋AOX2：当AOX1基因缺失，只存在AOX2时，大部分乙醇氧化酶活力丧失，细胞利用甲醇能力降低，在甲醇培养基上生长缓慢，这种菌株称为MutS12AOX1基因调控抑制机制：在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，抑制转录，Mut＋和MutS一样生长诱导机制：以甲醇为唯一碳源时，诱导基因转录、蛋白表达，Mut＋生长显著比MutS快用于表达的甲醇酵母受体菌：2.表达载体和受体菌**GS115、KM71、SMD1168均为组氨酸缺陷型：在没有组氨酸的培养基上细菌不能生长。如表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主的组氨酸缺陷，因此可在不含组氨酸的培养基上筛选转化子甲醇酵母表达载体的特点**15’AOX1：含AOX1启动子，可调控异源蛋白表达，同时也是载体和受体菌染色体发生重组的位点2MCS：多克隆位点，允许目的基因插入3TT：转录终止和多聚腺苷酸化序列，允许mRNA有效转录终止和多聚腺苷酸化43’AOX1：TT序列下游区域，同源重组位点之一5His4：编码组氨酸，提供转化子筛选标记，也是重组位点之一6Ampr：氨苄抗性基因，允许在大肠杆菌中筛选甲醇酵母的转化与目的基因整合**大肠杆菌表达载体：有复制子，可自行复制甲醇酵母表达载体：不含酵母复制起点同源重组：导入酵母体内的重组表达载体和酵