质粒提取及酶切鉴定.ppt

***左下角处有超级链接到配伍末端实验一质粒提取及酶切鉴定P158相关基础知识基因工程（geneticengineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。目的基因工具酶载体基因工程相关物质1质粒2存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的小型环状DNA分子(covalentclosedcircularDNA)。3具有自我复制功能。4带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物5经改造后具有多克隆位点。质粒(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状限制性核酸内切酶：------基因工程的手术刀是分子生物学研究中的一种工具酶，能识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：?EcoRⅠ：G↓AATTC?HindⅢ：A↓AGCTT概念01与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统（restriction-modificationsystem），限制外源DNA，保护自身DNA。02作用分类酶结构、作用、识别及切割特异性的不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，基因工程技术中常用Ⅱ型Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用，且识别及切割位点不同（下游100-1000bp）Ⅲ型酶具有限制和DNA修饰作用，识别及切割位点不同（相距较近）01识别及切割位点相同02识别序列通常为4～8bp的回文结构；03切割可产生两类切口，三种末端。Ⅱ型限制酶特点Ⅱ型酶识别序列特点—回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口钝性末端粘性末端掌握质粒DNA提取的原理与方法了解DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理质粒提取原理质粒的提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在碱性环境中，线性的大分子细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。01由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。02RelaxedcircleLinearizedformSuper-coiledform***左下角处有超级链接到配伍末端