菌种的复壮与保藏(陈).ppt

措施：阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发。方法：液体石蜡150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分→倒入菌种管中（高出1cm）→4℃保存。适用：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等保藏期：1～2年，或更长3214石蜡油封藏法040301措施：无营养，缺氧，干燥适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌方法：孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→5℃保藏保藏期：1~10年或更长02砂土管干燥保藏法河沙60目筛弃去大颗粒及杂质80目筛去掉细沙吸铁石吸去铁质10％～20％的盐酸浸泡24h去除有机物水洗至中性烘干或晒干土：取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛,水洗至中性，烘干。将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃湿热灭菌30min。沙：向培养好的斜面培养物中注入3～5mL无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。真空抽去沙土管中水分。将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4～6℃)干燥处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。保藏时间2～10年。沙土管恢复培养陈灵芝微生物教研室2011陈灵芝微生物教研室2011陈灵芝微生物教研室2011陈灵芝微生物教研室2011第三章菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退菌种衰退（degeneration）是指菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。01菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为衰退。02生长速度缓慢，产孢子越来越小。03代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。04致病菌对宿主侵染能力下降。05对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力的下降等。（一）菌种衰退的具体表现总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优势。有关基因发生负突变导致菌种衰退菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。质粒脱落导致菌种衰退质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。基因突变表型延迟造成菌种衰退如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。（二）菌种衰退的原因连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。010302连续传代不适宜的培养和保藏条件不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。（三）菌种衰退的防治控制传代次数即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的机率。01创造良好的培养条件05控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。03基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失。02结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞。04培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子。另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退，而改用子囊孢子移种则能避免衰退。在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就不会发生这种现象。0201利用不易衰退的细胞移种传代长期保藏——砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。在实践中，应当有针对性的选择菌种保藏的方法。短期保藏——一般斜面冰箱保藏法例如，酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低温保藏，其次是4℃低温保藏，而冷冻干燥保藏法和液氮保藏法并不理想。对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏