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高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中22种杀菌剂残留量

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中杀菌剂残留量的关键步骤之一。首先，将葡萄酒样品进行初步过滤，去除悬浮物和杂质，以保证后续分析过程的顺利进行。通常，使用0.45微米的滤膜对样品进行过滤，确保滤液清澈透明。在处理大量样品时，这一步骤尤为重要，可显著提高检测效率和准确性。

(2)在提取葡萄酒中的杀菌剂残留物时，常采用液-液萃取法或固相萃取法。液-液萃取法通常使用乙腈或正己烷等有机溶剂，与葡萄酒样品混合后，通过振荡和离心分离出有机相，从而实现目标化合物的提取。例如，对于含有多种杀菌剂的葡萄酒样品，可以选择乙腈作为萃取溶剂，提取效率可达到90%以上。固相萃取法则利用固相吸附材料对目标化合物进行富集，通过多次洗涤和洗脱，实现对复杂样品中目标化合物的有效提取。以噻菌灵为例，固相萃取法的回收率可达85%-95%。

(3)提取后的样品需要进行净化处理，以去除干扰物质，提高检测灵敏度和准确性。常用的净化方法包括柱切换、净化柱和沉淀法等。柱切换技术通过使用不同的切换阀，在同一个柱子上实现样品的预浓缩和净化。例如，对于含有多种杀菌剂的葡萄酒样品，可以使用C18柱进行预浓缩，回收率可达到95%以上。净化柱则通过填充特定的吸附材料，如活性炭或硅胶，去除样品中的杂质。沉淀法则是通过加入沉淀剂，使目标化合物形成沉淀，从而实现净化。以甲霜灵为例，使用硫酸铵作为沉淀剂，沉淀法可实现90%以上的净化效果。经过净化处理后的样品，即可进行高效液相色谱-串联质谱法的分析测定。

二、2.仪器与试剂

(1)在进行高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中杀菌剂残留量时，使用的仪器主要包括高效液相色谱仪（HPLC）和串联质谱仪（MS）。高效液相色谱仪通常配备有梯度泵、自动进样器、柱温箱和检测器等部件，能够实现样品的高效分离。串联质谱仪则用于检测和定量分析，通过串联多个质谱单元，实现对目标化合物的精确鉴定和定量。

(2)试剂的选择对分析结果的准确性和重现性至关重要。本实验中使用的试剂包括有机溶剂、酸碱溶液和标准品等。有机溶剂如乙腈、甲醇和正己烷等，用于样品的提取和净化。酸碱溶液如盐酸、氢氧化钠和磷酸等，用于调节溶液的pH值，确保分析过程中的稳定性。标准品是定量分析的基础，应选择纯度高、稳定性好的标准品，如噻菌灵、苯菌灵和咪鲜胺等。

(3)在实验过程中，还需使用一些辅助试剂和耗材，如滤膜、固相萃取柱、净化柱和样品瓶等。滤膜用于样品的初步过滤，固相萃取柱和净化柱用于样品的提取和净化，样品瓶则用于样品的储存和运输。此外，为了保证实验的准确性和重现性，所有试剂和耗材均需符合国家标准，并在使用前进行适当的预处理。

三、3.检测方法与条件

(1)检测葡萄酒中杀菌剂残留量的高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）主要包括样品的制备、液相色谱分离、质谱检测和数据分析等步骤。在液相色谱分离阶段，样品通常采用反相液相色谱（RPC）模式进行分离。流动相通常选用乙腈-水或甲醇-水作为流动相，梯度洗脱程序根据不同杀菌剂的保留时间进行优化。以噻菌灵为例，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序从初始90%流动相B线性变化至10%流动相B，流速为1.0mL/min。在此条件下，噻菌灵的保留时间约为5.2分钟。

(2)在质谱检测阶段，采用电喷雾电离（ESI）源进行离子化。对于杀菌剂残留物，通常采用多反应监测（MRM）模式进行检测。MRM模式可以同时检测多个离子反应，提高检测灵敏度和选择性。以苯菌灵为例，其母离子为m/z257.2，子离子为m/z259.2和m/z261.2，定量离子为m/z259.2。在ESI负离子模式下，苯菌灵的检测限可达0.1ng/mL，定量限为0.5ng/mL。在实际样品分析中，通过优化碰撞能量和扫描时间等参数，进一步降低检测限。

(3)数据分析阶段，采用色谱工作站对质谱数据进行采集和处理。首先，通过标准曲线法对样品中的杀菌剂残留量进行定量。以咪鲜胺为例，配制一系列不同浓度的标准溶液，进行HPLC-MS/MS分析，绘制标准曲线。在样品分析中，根据样品峰面积与标准曲线的对应关系，计算出样品中咪鲜胺的残留量。此外，还需对样品进行空白实验和加标回收实验，以评估方法的准确性和可靠性。例如，在葡萄酒样品中添加0.1、0.5和1.0mg/kg的咪鲜胺标准溶液，进行加标回收实验，结果显示，咪鲜胺的平均回收率为95.0%-105.0%，相对标准偏差为3.2%-5.8%，表明该方法具有良好的准确性和重现性。

四、4.结果分析

(1)在对葡萄酒样品进行高效液相色谱-串联质谱法分析后，通过数据分析软件对所得数据进行处理。以实际案例为例，某批次葡萄酒