质粒的提取与纯化.pptVIP

实验一质粒的提取(碱法)实验目的实验原理实验仪器、材料与试剂实验步骤实验结果及讨论01了解碱法提取质粒的原理；02掌握碱法提取质粒的方法。实验目的质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。实验原理质粒噬菌体酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体表达载体等种类：结构的三大要素：多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位pBCSKmapT-载体在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。1用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。2恒温摇床01超净工作台02高压灭菌锅03高速台式离心机04微量取液器05仪器实验仪器、材料与试剂01含pBCKS质粒的大肠杆菌DH5α。02含重组质粒的大肠杆菌DH5α。（二）材料胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。LB液体培养基（1L）01在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。LB固体培养基（1L）02（三）试剂SolutionⅠmmol/L葡萄糖mmol/LTris.·Cl(pH8.0)mmol/LEDTA(pH8.0)高压灭菌后，4℃保存备用。SolutionⅡ(现用现配制)0.2mol/LNaOH1%SDS5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸（pH4.8）。4.SolutionⅢ（100ml）01用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存备用。5.氨苄青霉素（Amp）02胰RNA酶将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。氯仿，乙醇，70%乙醇。质粒的提取用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基（含Amp0.1mg/ml）中，37℃振荡培养过夜。将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，10,000rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200μLSolutionI中,涡旋使充分悬浮。12345加入300μLSolutionIII,混匀（注意动作轻），冰箱3℃放置5min。加入300μLSolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3℃放置5min。实验步骤