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基于生物质谱的蛋白质N-糖基化定性与定量新技术

本论文研究内容涉及分析化学、化学生物学等二级学科,属交叉学科研究领

域。主要在生物质谱技术的基础上,发展针对蛋白质N型糖基化修饰定性与定量

研究的创新性技术与方法,以准确、高效地揭示蛋白质N-糖基化修饰的多方面信

息,包括糖蛋白／糖肽、糖基化位点、糖链等。

糖基化修饰是生命活动中最广泛、最复杂、也是最重要的蛋白质翻译后修饰

之一,不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位,而且在分子识别、

细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。糖蛋白根据其糖

链结构及糖基化位点的不同可分为三大类：N-糖蛋白、O-糖蛋白和GPI锚定蛋白,

其中又以N-糖蛋白分布最为广泛。

据推断,有超过50%的蛋白质都发生了糖基化修饰,但是现有数据库中只有

约10%的蛋白质被注释为糖蛋白,说明绝大多数糖蛋白尚未被发现。糖基化研究

仍处于起步阶段,缺乏高效的、成熟的技术手段。

在后基因组时代,基于对蛋白质高通量、系统性研究的蛋白质组学迅速兴起。

而以软电离为基础的生物质谱技术为蛋白质组学的快速发展提供了有力工具。

近年来,生物质谱技术同样被应用于糖基化修饰的研究,主要包括糖基化位

点的鉴定和糖链结构的解析等方面,而针对糖蛋白/糖链进行大规模研究的糖蛋

白质组学和糖组学也随之应运而生。然而,糖链属非模板合成,其结构极其复杂且

呈二维结构,同时糖链离子化效率低、同分异构体多,在质谱分析上仍存在诸多技

术瓶颈。

可见,糖基化领域的进一步发展亟待方法学上的新突破。本论文以生物质谱

技术为基础,从定性研究和定量研究两方面,发展了针对蛋白质N-糖基化修饰研

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究的新技术与新方法,致力于建立高效、实用的糖基化解析策略,解决当今糖蛋白

质组学与糖组学所面临的技术难题。

本论文工作的主要贡献如下：(1)成功将糖苷内切酶(Endo)应用于大规模、

高通量的N-糖基化位点质谱鉴定,与传统的肽N-糖酰胺酶(PNGase)形成互补,并

利用这两种酶切路线,从大鼠肝脏组织中鉴定到大量尚未被发现或证实的N-糖

基化位点；(2)首次发现Endo酶促N-糖18O标记反应,并基于此反应发展了酶促

糖链还原末端18O标记GREOL技术,有效用于糖链的质谱相对定量,弥补了定量糖

组学领域的一项技术空白；(3)通过条件优化,首次实现了PNGase酶促N-糖链的

18O标记,并基于此反应创新性地发展了酶促18O4标记技术,成功用于糖链、

糖肽、非糖肽的一步定量分析,在一次实验中实现了蛋白质N-糖基化的全方位定

量解析；(4)发展了硼氢化钠辅助的酶促N-糖链墙18O技术与18O+D双标记技术,

不仅大大增加了酶促糖链18O标记的稳定性,更通过双标记使糖链质量差异增加

到3Da,大大降低了同位素峰重叠效应的影响。针对上述几点,本论文分别从以下

几方面进行了阐述：基于糖苷内切酶(Endo)与肽N-糖酰胺酶(PNGase)互补的大

规模N-糖基化位点鉴定：蛋白质糖基化位点的大规模鉴定是糖蛋白质组学定性

研究的重要内容。

PNGaseF是目前普遍使用的鉴定N-糖基化位点的酶,该酶会使N-糖基化位

点的天冬酰胺去氨基化并发生+0.98Da的质量变化,以此作为标签,即可质谱鉴

定糖基化位点。然而,高通量、高效率的质谱分析难以兼顾灵敏度与分辨率,这使

得0.98Da质量差异的精确分辨在大规模的LC-MS分析中难以得到保证。

同时,天冬酰胺与