食品质量安全检测新技术.ppt

展望1PCR技术和以PCR技术为基础的分子生物学技术给现代生物学的研究带来了革命性的变化，微生物学自然也不例外，它们给微生物学的研究开辟了一个新的天地，微生物由于个体微小和本身研究的特殊性，相对与其他学科来说更需要PCR技术和以PCR技术为基础的分子生物学技术。相信随着科学技术的进一步发展及其在微生物学应用领域的扩大，它们必将发挥出更大的作用。2核酸分子杂交技术02第一节03原理：碱基互补配对原则核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)01来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。02杂交可分成：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之间的杂交。03复性RNADNA待测核酸序列探针(probe)：已知核酸序列二、DNA的变性(denaturation)成两条单链的过程。定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开01甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、02DNA变性的本质是双链间氢键的断裂Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，双链DNA变性一半所需要的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度(meltingtemperature,Tm)。其大小与G+C含量成正比。计算公式Tm=（G+C）%×0.41+69.3DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低。三、DNA的复性不同来源的DNA分子变性DNA-DNA杂交双链分子复性94℃30s℃45s℃1min×30次42℃forever94℃5min72℃7min12345经典循环参数（500bp以内）010203040506不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究PCR的类型01高浓度引物02低浓度引物2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列限制酶已知序列未知序列未知序列限制酶连接酶3）多重PCR（复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物123412344）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4PCR产物ＰＣＲ标记引物观察逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAPCR扩增杂化双链cDNA5）ＲＴ－ＰＣＲ蛋白质多肽链mRNA基因010203通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。6)荧光定量PCR（real-timePCR)光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。荧光定量PCR仪荧光定量实时PCR与普通PCR的比较实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性增加定量的精确性全程监控,准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便,无需跑胶全新4通道实时荧光定量PCR仪普通梯度PCR仪PCR技术的应用基因片段重组DNA1)