细胞化学与组织化学.ppt

组织化学技术PART1序言现代组织化学是介于细胞生物学、组织学、生物化学及分子生物学之间的一门新兴边缘学科，它已渗透和应用于生命科学的许多领域。近几十年来，组织化学发展突飞猛进，日新月异，已产生了许多分支，各类分支虽有特点，但都源于组织化学。因此，组织化学已成为医学生物学科研过程中必备知识之一。组织化学（histochemistry）/细胞化学(cytochemistry)是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学。主要研究对象是生物大分子(如核酸、蛋白质、酶、多糖和脂类等)在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化以及亚细胞组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。组织化学发展简史组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应，解释生物界中的生理现象。(1890一1920)随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组织学的概念转为显微化学。依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学反应形成酶细胞化学。70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，形成了定量细胞化学。STEP01STEP0280年代电镜细胞化学可以观察化学成分的亚细胞定位。～90年代，先后流式细胞术、激光扫描共聚焦显微技术出现。激光扫描共聚焦显微技术，相似于对单个细胞进行细胞“CT”分析，并能研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器的酶含量，细胞内各种荧光标记物(包括分子和离子的浓度及其分布，如Ca2+和pH值等)，流式细胞术是一种快速对单细胞化学成分定量分析的新技术，每秒可测上万细胞信息，从一个细胞中，可同时测量多种参数。组织化学技术的基本要求尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。必须选择适当的固定液和恰当的处理方法。化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不移位，不弥散。反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。三、细胞化学技术显示的化学成分：蛋白质：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基；RNA和DNA；糖类：如糖原、粘多糖和糖脂等；脂类：如中性脂肪、磷脂和胆固醇等；酶：包括水解酶(如磷酸酶、酯酶、肽酶)、氧化酶(琥珀酸脱氢酶、过氧化酶、细胞色素氧化酶)和激酶、转移酶等；生物胺：5-羟色胺、肾上腺素类、组织胺等；特异抗原：其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等；无机盐和微量元素：如铁、铜、锌、钴、镁等。细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的反应产物。常用组织化学方法的原理如下：细胞化学染色的原理：一）金属-金属盐沉淀反应原理利用金、银、铜、铁、铝、钴等金属化合物在与细胞化学成份反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质。如磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅/钴形成磷酸铅，在硫存在时形成PbS或CoS的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部位。二）偶氮偶联法原理用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而形成不溶性的偶氮色素。α萘基磷酸钠磷酸氢二钠＋α萘酚α萘酚＋FASTBLUE偶氮染料↓碱性磷酸酶＋水三）过碘酸Schiff氏剂反应法原理利用细胞中多糖放出的醛基可将Schiff氏剂中的无色品红转变为紫红色化合物，可于显微镜下观察到。这种反应多用于显示细胞中的糖类和细胞核内的DNA，前者称为PAS反应，后者称为Feulgen反应。此外，还可用于检查细跑中的粘蛋白和不饱和脂类。四）联苯胺法原理过氧化氢酶分解H2O2产生新生氧，后者可将无色联苯胺氧化，生成联苯胺蓝，进而变成棕黑色化合物。此法主要显示细胞中的过氧化物酶。五）色素形成法原理是一组显示酶定位的常用方法，其原理是在酶的作用下，使无色的化学物质在细胞局部形成色素沉着，以此确定待测酶的存在部位。色素形成法主要包括四唑盐法（NBT、MTT）、靛蓝形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶。靛蓝反应用于酯酶、磷酸酶等六）底物标记法原理底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物，在酶的作