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寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基；注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长，则说明CDS序列稳定可用；将查到的CDS序列粘贴至newDNAfile框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该段序列中的可能酶切位点二.登录找到质粒的全序列同样将该质粒序列粘贴至软件中，比较目的基因和质粒的多克隆位点（即酶切位点）质粒选择酶切位点的原则：目的基因上不能存在将要使用的酶的酶切位点，否则目的基因会被切掉；质粒上选择酶切位点应该尽可能短，为将来其他可能的克隆预留位置，如本实验质粒选择Aflll和BamH1，目的基因上均不存在酶切位点，实验室也买了，可用：选中目的基因序列，复制在AflI后至BamHI前的序列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HAtag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询：三.克隆引物设计电脑设计：回到NCBI的primerblast，拷贝目的基因CDS序列(共1602个碱基)，在框中输入|a|和CDS序列，并在Min和Max分别输入1602（表示blastCDS全部基因）；01022.手工设计：遵循GC尽量少，Tm尽量小的原则，5端后选20个左右；3端从酶切位点终点往前数59个，因为除去CDS框的20个碱基后还要包括HA位点和酶切位点序列。
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