靶向降解表皮生长因子受体EGFR功能多肽的制备及其抗肿瘤作用研究.pdfVIP

摘要

表皮生长因子受体EGFR在多种恶性肿瘤中过度表达，下调EGFR表达是一种治

疗EGFR高表达恶性肿瘤的有效手段。本论文设计了一种特异性靶向降解EGFR的功

能多肽ALT-R9和ALT-TAT，以期为治疗EGFR高表达恶性肿瘤提供新的策略。

本论文首先构建了pET-21b-His-ALT-TAT和pET-21b-His-ALT-R9重组质粒，将重

组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导重组蛋白ALT-R9和

ALT-TAT表达，并利用镍柱亲和层析技术纯化得到了0.79mg/mLALT-R9和0.68

mg/mLALT-TAT重组蛋白。其次，Co-IP实验表明重组蛋白ALT-R9和ALT-TAT

能够与EGFR和NEDD4相互作用；进一步免疫荧光技术检测表明，重组蛋白

ALT-R9和ALT-TAT能有效进入肺癌NCI-H460细胞并与EGFR共定位；重组

蛋白处理MDA-MB-231乳腺癌细胞发现，ALT-R9和ALT-TAT以蛋白浓度和处

EGFRALT-R9EGFR

理时间依赖性方式诱导内源性降解，降解的作用效果更为

显著，EGFR蛋白水平显著降低71%；蛋白免疫印迹实验检测表明ALT-R9通

过泛素-蛋白酶体途径诱导EGFR降解，并抑制EGF诱导的EGFR信号通路的

激活。再次，MTT实验、细胞克隆形成实验、Ki-67实验、细胞划痕等体外实

验表明ALT-R9诱导EGFR降解可以抑制NCI-H460细胞活力、细胞增殖和细胞

迁移并且促进NCI-H460细胞凋亡；对ALT-R9诱导EGFR降解机制进行了探究

发现，ALT-R9诱导EGFR降解依赖E3泛素连接酶NEDD4。最后，建立肺癌

NCI-H460细胞裸鼠荷瘤模型，经腹腔注射浓度5mg/kg、15mg/kg的ALT-R9

20ALT-R95mg/kg15

重组蛋白处理天后，检测体内抗肿瘤的作用，结果发现、

mg/kg47.9%g82.9%ALT-R9

两个给药组的小鼠肿瘤抑制率为、，处理显著抑制肿瘤

的生长；蛋白免疫印迹和免疫组化实验表明ALT-R9可以诱导小鼠体内肿瘤组

织中EGFR的降解。

综上所述，本论文设计和制备了一种特异性靶向降解细胞内源性EGFR的功能性

多肽ALT-R9和ALT-TAT，它们通过泛素-蛋白酶体途径降解EGFR，抑制EGFR信

号通路，从而发挥抗肿瘤作用，这为EGFR高表达恶性肿瘤的治疗提供了新策略。

关键词：表皮生长因子受体；靶向蛋白降解技术；泛素连接酶；细胞穿膜肽

ABSTRACT

TheepidermalgrowthfactorreceptorEGFRisoverexpressedinavarietyof

malignancies,anddown-regulationofEGFRexpressionisaneffectivemeansoftreating

EGFR-highexpressingmalignancies.Inthisthesis,wedesignedafunctionalpeptide

ALT-R9andALT-TATthatspecificallytargetthedegradationofEGFRinordertoprovidea

newstrategyforthetreatmentofEGFRhighlyexpressedmalignancies.

ThepaperfirstlyconstructedpET-21b-His-ALT-TATandpET-21b-His-ALT-R9

recomb