TLR-4的N-糖基化修饰影响结肠癌相关巨噬细胞极化.pdf

摘要

肿瘤相关巨噬细胞（TumorAssociatedMacrophages,TAMs）是肿瘤微环

境中重要的免疫细胞之一，可通过影响非特异性免疫和特异性免疫过程介导

肿瘤进展。TAMs具有促炎表型的M1型和抑炎表型的M2型两种极化状态，

但目前TAMs中影响其极化状态的机制尚未完全阐明。Toll样受体4

（Toll-likereceptor4,TLR-4）是TAMs表面重要的N-糖蛋白受体，已有文献

报道TLR-4参与了TAMs的极化过程，但TLR-4上特定N-糖链对该过程的

影响仍不清楚。本论文以TLR-4为切入点，开展了TLR-4依赖于其N-糖链

对TAMs极化的影响及相关机制的初步探究。

本文首先构建结肠癌TAMs模型，qRT-PCR和WesternBlot分析发现，

TAMs中M2型巨噬细胞标志物表达量显著升高，M1型巨噬细胞标志物表达

量显著降低，说明TAMs呈现M2型极化状态，该模型将用于后续研究。在

结肠癌TAMs模型中，发现TLR-4表达量显著降低，siTLR-4处理RAW264.7

巨噬细胞后，发现巨噬细胞呈M2型极化状态；而用TLR-4-FLAG表达载体

瞬转RAW264.7巨噬细胞，发现巨噬细胞呈M1型极化状态，表明TLR-4能

够诱导巨噬细胞极化过程。在此基础上，将CT26细胞分别与EGFP/RAW264.7、

CAS9-TLR4/RAW264.7细胞混合并于小鼠皮下接种，发现与EGFP/RAW264.7

细胞相比，CAS9-TLR4/RAW264.7细胞能显著促进CT26细胞成瘤大小，同

时瘤体中M2型TAMs数量增加，提示TLR-4能在体内调控结肠癌TAMs向

M2型极化并促进结肠癌进展。

TLR-4作为一种N-糖蛋白，其N-糖链的功能报道较少。本论文研究了细

胞N-糖链对巨噬细胞的影响，使用N-糖链抑制剂处理RAW264.7细胞后，发

现其能够诱导巨噬细胞向M2型转化，表明N-糖链能影响巨噬细胞极化。在

此基础上，研究了N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V（N-acetylglucosamine

transferaseV,GnT-V）在这一过程中的作用。发现结肠癌TAMs中GnT-V表

达降低，β-1,6-N-糖链表达降低。将GnT-V-EGFP表达载体瞬转TAMs，M2

型TAMs向M1型转化，使用衣霉素处理后TAMs则向M2型转化，提示GnT-V

通过形成N-糖链影响TAMs极化。进一步IP-凝集素杂交实验发现TLR-4上

存在GnT-V调控的β-1,6-N-糖链，在过表达GnT-V的TAMs中敲低TLR-4，

GnT-V调控TAMs向M1型转化的作用被显著抑制，通过构建TLR-4上524

位与572位氨基酸N-糖基化位点突变体，发现与野生型TLR-4诱导RAW264.7

细胞向M1型极化相比，N-糖基化位点突变后诱导RAW264.7细胞向M2型

转化，以上结果表明结肠癌TAMs中TLR-4是依赖于GnT-V调控的N-糖链

修饰影响其极化。

为解析这一机制，在RAW264.7细胞中敲低GnT-V，发现TLR-4表达量

显著降低，而在过表达GnT-V后，发现TLR-4表达量显著升高。放线菌酮

实验结果表明，细胞中TLR-4稳定性显著降低，过表达GnT-V后能显著提

高TLR-4稳定性，维持其表达。以上结果说明结肠癌TAMs中，GnT-V可以

通过调控TLR-4上N-糖链修饰，影响TLR-4稳定性，进而诱导TAMs向M2

型极化促进结肠癌进展。

综上，本文初步探讨了TLR-4依赖于其N-糖链对TAMs极化的影响及相

关机制，该结果帮助我们进一步了解TLR-4在TAMs极化中的作用，并对结

肠癌相关研究具有十分重要的意义和临床价值。

关键词:肿瘤相关巨噬细胞；极化；TLR-4；N-糖链

Abstract

Tumorasso