重组DNA技术简介.ppt

、过程取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值计算2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释稀释以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零对照调零1?g/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02计算DNA含量（?g）＝50x(260nm的读数）x稀释倍数3、基因的运输工具——运载体能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。练习在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶基因工程常用的受体细胞有（）(1)大肠杆菌（2）枯草杆菌（3）支原体（4）动植物细胞A.（3）（4）B.（1）（2）（4）C.（2）（3）（4）D.（1）（2）（3）不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD练习基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）人工合成目的基因目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达C练习大肠杆菌(EcoRI)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶黏性末端黏性末端什么叫平末端？平末端是如何形成的？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。大多数来自于原核生物要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？会产生相同的黏性末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？限制性内切酶来自哪里呢？思考题：分子杂交技术的种类有哪些？什么叫做分子杂交？分别有什么应用？PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性3、PCR原理多聚酶链式反应扩增DNA片断高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化4、TaqDNA聚合酶的应用5、缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行6、PCR技术的特点PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液1PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸2细胞内复制和PCR不同点3PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸循环过程变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备（五）PCR的反应过程PCR循环第一步：加热变性靶序列靶序列②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第