巴斯德毕赤酵母L-苯丙氨酸高效合成苯乙醇的代谢研究.pdfVIP

摘要

苯乙醇具有令人愉悦的玫瑰花香气，是最主要的大宗香料之一，被广泛应用于

食品、化妆品等行业。传统化学法生产苯乙醇纯度低，副产物芳烃衍生物具有一定

毒性。近年来，合成生物技术的飞速发展为生物法高效合成苯乙醇提供可能。与酿

酒酵母相比，毕赤酵母是Crabtree阴性菌，不会将碳通量转移到乙醇的合成上，碳在

各个代谢途径之间分配均衡，是天然产物合成的高潜力底盘。毕赤酵母具有天然合

成苯乙醇的能力，细胞密度高，生长迅速。因此本研究以毕赤酵母作为底盘菌株，

通过基因工程手段对艾利希途径合成2-苯乙醇的相关基因进行敲除和过表达，并通

过培养基优化进一步提高2-苯乙醇产量。为后续构建高产苯乙醇毕赤酵母菌株奠定

了基础。主要研究内容和结果如下：

（1）通过转录组测序技术，在添加2g/L苯丙氨酸发酵条件下，选取表达水平

随发酵进程显著上调且与艾利希途径相关的3个模块共计13个基因：氨基酸转运模

块（AVT1、LYP1、PUT4、BUL1）；转氨反应模块（ARO9、ARO8、HIS5、BAT1、

AAT2）和脱氢反应模块（CAD1、CAD3、ADH2、ALD4）。因此，将以上13个基因

作为后续的研究对象。

（2）为构建高产苯乙醇毕赤酵母，本实验利用基因工程手段，以GS115为出发

菌株，构建了差异基因过表达菌株。结果显示分别过表达ARO8、AAT2、AVT1、

PUT4和ALD4基因的重组菌株的2-苯乙醇产量提高到1.4g/L、1.39g/L、1.59g/L、

1.29g/L和1.27g/L。

（3）为了进一步解析表达差异基因对2-苯乙醇合成的影响，将上述过表达无显

著效果的基因进行了敲除验证，结果显示除敲除菌株GS115△BAT1和GS115△

CAD3苯乙醇产量分别提高了12%和23%之外，而其他敲除菌株的2-PE产量无明显

变化。

（4）采用了组合代谢工程方法来优化毕赤酵母中的天然艾利希途径。在实验室

已构好的重组菌株GS115∷SCARO10的基础上叠加过表达脱氢酶基因ALD4转运蛋

白基因AVT1和PUT4和转氨酶基因ARO8和AAT2。最终获得重组菌株GS115∷

SCARO10∷ALD4∷AVT1∷ARO8在5g/LL-苯丙氨酸条件下可产2-苯乙醇2.49g/L，

苯乙醇产量与野生型相比提高了3倍。

（5）为进一步提高苯乙醇产量，对发酵培养基组分进行优化。对2-苯乙醇的合

成与葡萄糖浓度、L-苯丙氨酸浓度、接种量、不同氮源以及萃取剂的关系进行了考

察。总体上培养基的优化并未提高重组菌株的2-苯乙醇产量。

关键词：毕赤酵母；苯乙醇；艾利希途径；转录组测序技术；苯丙氨酸

ABSTRACT

2-Phenylethanolhasapleasantrose-likearomaandisoneofthemostimportantbulk

fragrances,whichiswidelyusedinfoodandcosmeticindustries.Traditionalpetrochemical

productionof2-phenylethanolhaslowpurity,theby-productaromaticderivativesaretoxic.

Inrecentyears,therapiddevelopmentofsyntheticbiotechnologyhasprovidedthepossibility

ofefficientsynthesisof2-phenylethanolbybiologicalmethods.Pichiapastorishasthe

abilitytosynthesize2-phenylethanolnaturally.Pichiapastorishashighcelldensityandrapid

growth.IncontrasttoSaccharomycescerevisiae,whichisCrabtree-negativeanddoesnot