代谢工程改造棒状链霉菌提高柚皮素的产量.pdf

摘要

柚皮素是植物中广泛存在的一类重要次级代谢产物，属于黄酮类化合物的一个黄

烷酮亚类，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗脂肪和心脏保护等多种生

物活性。但是目前柚皮素的生产主要依赖于从植物中提取，由于植物黄酮类化合物的

生产率低，回收的黄酮类化合物复杂，限制了植物黄酮类化合物的生产。虽然黄酮类

化合物也可以通过化学方法合成，但是有毒化学品和极端反应条件的使用限制了化学

合成法的推广应用。相比之下微生物发酵法生产柚皮素具有不受气候季节限制、环境

友好而越来越受到重视。棒状链霉菌是目前已知的唯一一个可以天然产生柚皮素的原

核微生物。本研究以棒状链霉菌为研究材料，通过培养基优化和合成途径强化初步探

究了棒状链霉菌发酵生产柚皮素的影响因素和关键节点。具体研究内容和结果如下：

（1）棒状链霉菌发酵培养基的优化：葡萄糖为碳源的TSB培养基是在棒状链霉

菌中发现柚皮素时采用的初始培养基。本研究首先对发酵培养基的碳源进行优化，通

过对7种碳源进行筛选，我们发现棒状链霉菌生产柚皮素的最适碳源为糊精，在糊精

浓度为50g/L的TSB培养基中，柚皮素的产量为9.61mg/L。

（2）柚皮素合成途径中关键基因的代谢工程改造：酪氨酸氨基裂解酶（TAL）、

4-香豆酸CoA连接酶（4CL）、柚皮素查尔酮合成酶（NCS）和查尔酮异构酶（CHI）

是植物柚皮素合成途经的关键组分。其中三个组分的编码基因：酪氨酸氨基裂解酶基

因（tal）、4-香豆酸CoA连接酶基因（4cl）、柚皮素查尔酮合成酶基因（ncs）都存在

于棒状链霉菌的基因组上。3个基因位于基因组上的不同位置，与ncs位于同一个转

录单元的NCYP450编码基因（ncyP）也可能参与了柚皮素的合成过程。本研究围绕上

述4个基因对棒状链霉菌进行了代谢工程改造。首先采用强启动子rpoDp，分别构建

了ncs过表达菌株（S3201）和tal过表达菌株（S3207），发酵分析显示ncs过表达菌

株柚皮素的产量达13.22mg/L，tal过表达菌株柚皮素的产量达21.4mg/L，分别比野

生型提高了37.6%和122.7%。进一步的，我们构建了4个基因（tal,4cl,ncs,ncyP）共

过表达菌株（S3213）。共过表达菌株的柚皮素产量达23.35mg/L，比野生型菌株提高

了143%。

（3）柚皮素合成途径的异源表达：以模式菌株StreptomyceslividansTK24和

Streptomycesvenezuelae为宿主，我们分别构建了棒状链霉菌柚皮素合成途径的异源表

达菌株：S3216和S3219。对S3216和S3219菌株进行发酵，没有发现柚皮素的产生。

以（tal,4cl,ncs,ncyP）4个基因为主的柚皮素合成途径的异源表达的失败，暗示目前

棒状链霉菌中已知的柚皮素合成途径可能并不完整，新的柚皮素合成关键基因有待进

一步挖掘。

总之，本研究通过培养基优化发现了棒状链霉菌柚皮素发酵生产的最优碳源，通

过代谢工程改造发现了棒状链霉菌中柚皮素合成途径的关键节点，通过异源表达研究

发现了棒状链霉菌中现有合成途径的可能不完整性。上述研究发现为棒状链霉菌柚皮

素发酵生产的开发与最终推向应用打下了良好的基础。

关键词：柚皮素；棒状链霉菌；过表达；培养基优化

ABSTRACT

Naringeninisanimportantsecondarymetabolitewidelyexistinginplants.Itbelongs

toasubclassofflavanoneofflavonoidsandhasavarietyofbiologicalactivitiessuchas

antioxidant,antitumor,antiviral,antibacterial,anti-inflammatory,anti-fatandheart

protection.However,currently,theproductionofnaringeninmainlyreli