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针对SRBSDV水稻病毒的ELISA检测方法

水稻病毒的主要检测方法：

病株症状观察:但前期感染水稻无典型症状特征，且无法观察稻飞虱是否带病毒；

电镜观察；

RT-PCR和qRT-PCR方法；

核酸检测方法：核算杂交和测序；

高通量的血清方法：ELISA(dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA、TAS-ELISA)、免疫胶体金试纸条；

血清学检测方法关键是获得高特异性、高灵敏度的病毒抗体

把具有免疫活性的免疫蛋白(抗原或抗体)结合到某种固相载体表面。使该免疫蛋白与某种特异性的酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体在检测中由于未经过其他任何处理,所以既有免疫活性,同时又保留其酶的活性。在试验时,把受检样品(待测的抗原或抗体)与酶标抗原或抗体按不同的步骤在固相载体表面起反应。然后用缓冲液洗漆,使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开。在一定范围内,结合在固相载体上的酶量与样品中受检物质的量成一定的比例关系。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,因为产物的量与样品中受检物质的量直接相关,故可根据反应物颜色的深浅进行定性或定量分析。由于酶是一种生物催化剂,催化效率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的灵敏度。

dot-ELISA实验方法：

具有典型矮缩症状和条纹叶枯症状的水稻植株

采自田间水稻植株上的白背飞風材料，暂时浸泡在无水乙醇中备用。

材料：

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用感染RBSDV的玉米病叶的粗提液作为免疫抗原

合成SRBSDVCP蛋白的多肽与牛血清白蛋白交联成免疫抗原

上述2种制备的抗原分别免疫BALB/C小鼠，分别制备RBSDV、SRBSDV的单抗。

抗原：

02

试剂：

包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液,pH9.6):1.59g_x001A_𝑁𝑎_x001B_2_x001B_C_x001A_𝑂_x001B_3_x001B_,2.93gNaHC_x001A_𝑂_x001B_3_x001B_,溶于800mL蒸馏水中后,定容至1000mL;

抗体稀释液(ELISA缓冲液):称取1g脱脂奶粉,2gPVP(polyvinyl-pyrrolidone,分子量为40000)溶于100mLPBS-T;

磷酸盐缓冲液(10xPBS,PH7.4):80gNaCl,2gKCl,1.44g_x001A_𝑁𝑎_x001B_2_x001B_HP_x001A_𝑂_x001B_4_x001B_,2.4gK_x001A_𝐻_x001B_2_x001B_P_x001A_𝑂_x001B_4_x001B_,溶于800mL蒸馏水后,定容至1000mL;

封闭液:a、称取5g脱脂奶粉溶于100mLPBS-T;b、称取0.2g牛血清蛋白(BSA)溶于100mLPBS-T;

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底物:p-NPP(p-nitrophenyphosphate)

洗漆缓冲液(PBS-T):取100mL10xPBS,加入0.5mLTween-20,定容至1000mL;

底物缓冲液:97mL二乙醇胺(diethanolamine),0.1gMg_x001A_𝐶𝑙_x001B_2_x001B_,溶于800mL蒸馆水中,用浓盐酸调PH至9.8,最后定容至1000mL

01

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仪器设备：

酶标仪(Bio-rad产品);移液枪、小型台式离心机、振荡器、(Eppendorf产品);-80℃超低温冰(THERMO产品);以及叶片汁液提取仪、洗板机、振荡仪、超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅、4℃冰箱、恒温培养箱等常规仪器和ELISA板、铝箔纸、枪头等耗材。

包被:将单头飞風置于2mLeppendorf离心管中,并放入一颗玻璃珠,用液氮速冻后在振荡仪上振荡(频率20/s,3min),取出玻璃珠,加300µL包被液,低速离心后备用,叶片用叶片汁液提取;

封闭:加封闭液,37℃恒温箱,孵育Ih;

点样:样品离心后取上清液点于ELISA板上(96孔板,每100µL),4℃,12h;

加兔抗血清(一抗):加稀释一定倍数的抗体,37°C恒温箱,孵育2h;

实验步骤：

1

加酶标二抗:二抗为羊抗兔IgG-碱性磷酸酶,(Sigmar,按1:10000稀释)溶于抗体稀释液中,37℃恒温箱,孵育2h;

2

加显色剂:加1 mg/mL的p-NPP(Sigma,溶于底物缓冲液中),置于37℃恒温箱,避光显色30min~50min,注意观察显色情况;

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读板:用酶标仪测定值(BIO-RAD公司生产)从第(2)步至第(5)步,每步操作之后用PBS-T洗漆液在洗板机上自动洗板3次;除封闭液加入200µL/孔洗板:其余步骤液体均加100µL/孔

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