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柱后衍生-HPLC测定与分析沉香中黄曲霉毒素

一、1.检测原理与方法

(1)黄曲霉毒素检测是保障食品安全的重要环节，其中柱后衍生-HPLC法因其高灵敏度和高选择性而被广泛应用于黄曲霉毒素的定量分析。该方法基于黄曲霉毒素分子结构中的双键与特定试剂发生加成反应，形成衍生化产物，从而提高其在色谱柱上的保留时间，便于分离和检测。

(2)在检测过程中，首先将样品进行提取和净化，以去除干扰物质。提取通常采用溶剂萃取法，如乙腈-水溶液，以充分提取样品中的黄曲霉毒素。净化则通过固相萃取柱（SPE）进行，以去除杂质和干扰物质，提高检测的准确性。

(3)柱后衍生化过程通常在样品进入检测器之前进行，通过将衍生化试剂注入流动相中，与样品中的黄曲霉毒素发生反应。衍生化产物的生成有助于提高黄曲霉毒素的检测灵敏度，同时通过优化色谱条件，如流动相组成、流速、柱温等，可以实现对不同类型黄曲霉毒素的准确分离和定量。

二、2.仪器与试剂

(1)仪器方面，柱后衍生-HPLC法通常需要以下设备：高效液相色谱仪（HPLC），配备紫外检测器（UV）或荧光检测器（FLD），以及柱后衍生装置。其中，高效液相色谱仪应具备较高的灵敏度，如配备荧光检测器时，最低检测限可达ng/L级别。例如，Agilent1290HPLC系统，配备荧光检测器，可实现对黄曲霉毒素B1的检测限达到0.5ng/mL。

(2)在试剂方面，主要涉及衍生化试剂、提取溶剂和净化试剂。衍生化试剂如2,4-二硝基苯肼（DNPH）是常用的衍生化试剂，其在衍生化过程中与黄曲霉毒素分子中的双键发生反应。提取溶剂通常选择乙腈、甲醇等极性溶剂，以充分提取样品中的黄曲霉毒素。净化试剂如C18固相萃取小柱，可去除样品中的杂质，提高检测的准确性。以C18固相萃取小柱为例，其吸附容量约为50mg/g，可满足多数样品的净化需求。

(3)实际应用中，选择合适的仪器和试剂对黄曲霉毒素的检测至关重要。例如，在检测大米中黄曲霉毒素B1时，采用乙腈-水溶液提取，C18固相萃取小柱净化，柱后衍生化后，使用HPLC-FLD进行检测。在此条件下，黄曲霉毒素B1的检测限可达0.5ng/g，满足国家标准GB5009.24-2016的要求。此外，通过优化流动相组成、流速、柱温等色谱条件，可实现对不同类型黄曲霉毒素的准确分离和定量。

三、3.样品前处理

(1)样品前处理是柱后衍生-HPLC测定黄曲霉毒素的关键步骤，它直接影响到后续分析的准确性和灵敏度。以食品样品为例，如大米、玉米等，首先需将样品进行粉碎和混合，以确保样品的均匀性。通常，样品粉碎后过筛，筛孔大小一般为0.25毫米，以获得均匀的粉末。

(2)接下来，根据样品的基质特性选择合适的提取溶剂。对于含有脂肪的样品，如玉米，常用乙腈-水溶液作为提取溶剂，比例为80:20（V/V）。提取过程中，样品与溶剂以1:10（w/v）的比例混合，在超声波浴中提取30分钟，以确保黄曲霉毒素充分溶解。提取完成后，将溶液通过C18固相萃取柱进行净化，以去除干扰物质。

(3)净化后的溶液需在50°C条件下进行蒸发浓缩，以去除大部分溶剂。蒸发浓缩后，残渣用少量流动相复溶解，并通过0.22微米的滤膜过滤，以确保样品溶液的纯度和稳定性。以实际案例为例，某品牌大米样品中黄曲霉毒素B1的检测，通过上述前处理步骤，样品溶液中黄曲霉毒素B1的回收率在80%至120%之间，满足检测要求。此外，前处理过程中，还需注意控制操作温度和时间，以避免黄曲霉毒素的热分解和氧化降解。通过优化前处理条件，如提取溶剂的选择、提取时间、净化方法等，可进一步提高检测的准确性和灵敏度。

四、4.柱后衍生-HPLC分析条件

(1)柱后衍生-HPLC分析黄曲霉毒素时，选择合适的色谱柱和流动相至关重要。常用的色谱柱为C18反相色谱柱，如AgilentZorbaxEclipseXDB-C18柱，柱长为4.6mm×150mm，粒径为5μm。流动相通常为乙腈-水溶液，比例为80:20（V/V），流速为1.0mL/min。在实际应用中，通过优化流动相的pH值和添加适量的有机酸或碱，如磷酸，可提高分离效果。

(2)柱后衍生化是提高黄曲霉毒素检测灵敏度的重要步骤。衍生化试剂通常为2,4-二硝基苯肼（DNPH），在衍生化过程中，DNPH与黄曲霉毒素分子中的双键发生加成反应，形成稳定的衍生物。衍生化条件包括衍生化温度、时间和衍生化试剂的浓度。以黄曲霉毒素B1为例，衍生化温度通常控制在50°C，衍生化时间为30分钟，DNPH浓度为10mg/mL。

(3)在检测过程中，荧光检测器（FLD）是常用的检测器，其检测限可达ng/L级别。为提高检测灵敏度，可优化荧光检测器的激发波长和发射波长。以黄曲霉毒素B1为例，激发波长为365nm，发射波长为430n