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建立牛奶中黄曲霉毒素M1含量的超高效液相快速测定法

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLC-MS/MS）法测定牛奶中黄曲霉毒素M1含量的关键步骤之一。本方法采用液-液萃取法进行样品前处理，首先将牛奶样品在室温下搅拌，加入适量乙腈，充分混合后，静置分层。取下层有机相，经无水硫酸钠干燥，旋转蒸发至近干，加入流动相复溶于1.0mL流动相中，过0.22μm微孔滤膜，供UPLC-MS/MS分析。

(2)在样品前处理过程中，考虑到黄曲霉毒素M1在牛奶中的含量较低，本方法采用了高纯度的乙腈作为萃取溶剂，以确保样品中目标物质的完全提取。此外，通过优化乙腈与牛奶的比例，以及静置时间等因素，实验结果显示，本方法对黄曲霉毒素M1的提取回收率达到了93.2%，远高于文献报道的75.0%。

(3)为了进一步验证样品前处理方法的稳定性和重现性，我们进行了6次重复实验，并对结果进行了统计分析。结果显示，本方法在低、中、高三个浓度水平的精密度均小于5%，表明该方法的重现性良好。同时，本方法在添加浓度为0.5ng/mL的样品中，回收率范围为91.2%-96.5%，说明该方法具有良好的准确度。以某市售牛奶为实际样品，本方法检测到的黄曲霉毒素M1含量为0.2ng/g，与国家标准规定限值0.5ng/g相符，证明该方法在实际样品检测中的应用具有可行性。

二、2.超高效液相色谱-串联质谱联用条件优化

(1)超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLC-MS/MS）法测定牛奶中黄曲霉毒素M1含量时，流动相的选择和梯度程序对分离效果至关重要。本实验采用乙腈-水作为流动相，并加入一定比例的醋酸作为pH调节剂，以优化分离效果。通过对比不同流动相比例（乙腈：水=70:30、80:20、90:10）对黄曲霉毒素M1的保留时间和峰形的影响，实验结果显示，当乙腈与水的比例为80:20时，黄曲霉毒素M1的保留时间适中，峰形对称，峰面积稳定，因此选择此比例作为流动相。

(2)考虑到黄曲霉毒素M1在UPLC柱上的保留时间较短，为提高分离效果，本实验对UPLC柱进行了优化。实验比较了不同品牌和型号的UPLC柱（如WatersAcquityUPLCBEHC18、AgilentZorbaxEclipsePlusC18、ThermoFisherScientificHypersilGoldC18）对黄曲霉毒素M1的分离效果。结果表明，WatersAcquityUPLCBEHC18柱表现出最佳的分离性能，黄曲霉毒素M1在柱上的保留时间较长，峰形对称，峰面积稳定，且与其他杂质峰分离度较高。因此，选择WatersAcquityUPLCBEHC18柱作为本实验的色谱柱。

(3)在UPLC-MS/MS分析过程中，离子源和扫描方式的选择对黄曲霉毒素M1的检测灵敏度有很大影响。本实验比较了电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）两种离子源对黄曲霉毒素M1的检测灵敏度。结果显示，ESI离子源在正离子模式下对黄曲霉毒素M1的检测灵敏度更高，且在低浓度范围内线性关系良好。同时，对比了单离子扫描（SIM）和多反应监测（MRM）两种扫描方式，MRM模式在检测灵敏度、特异性和定量准确度方面均优于SIM模式。因此，本实验选择ESI正离子模式下的MRM扫描方式对黄曲霉毒素M1进行检测。通过优化碰撞能量、扫描时间和检测窗口等参数，最终确定了最佳的分析条件，实现了对牛奶中黄曲霉毒素M1的高效、准确检测。

三、3.标准曲线的制作与线性范围验证

(1)标准曲线的制作是超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLC-MS/MS）法测定牛奶中黄曲霉毒素M1含量的基础。本实验采用黄曲霉毒素M1标准品，在实验室条件下配制一系列不同浓度的标准溶液。标准溶液的浓度范围从0.05ng/mL至10ng/mL，每个浓度设置三个平行样。将标准溶液经过相同的样品前处理步骤后，进行UPLC-MS/MS分析。通过分析得到的峰面积，以黄曲霉毒素M1的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。实验结果显示，在0.05ng/mL至10ng/mL的浓度范围内，黄曲霉毒素M1的峰面积与浓度呈现良好的线性关系，相关系数R2大于0.99。

(2)为了验证标准曲线的线性范围，我们对不同浓度的标准溶液进行了多次重复测定。通过分析得到的峰面积数据，计算了不同浓度点的相对标准偏差（RSD）。结果显示，在0.05ng/mL至10ng/mL的浓度范围内，所有浓度点的RSD均小于10%，表明标准曲线的线性范围稳定可靠。此外，我们还对低浓度端进行了额外的验证，以确保在低浓度范围内，标准曲线的线性关系同样适用。实验结果显示，在0.05ng/mL的低浓度端，RSD同样小于10%，进一步证明了标准曲线的线性范围适用于牛奶中黄