代谢工程改造黑曲霉生产衣康酸.pdf

摘要

衣康酸是有机合成高分子材料中的重要的生物质来源的单体分子，黑曲霉作

为高产柠檬酸的微生物细胞工厂，发酵过程中不产生毒素且对工业发酵适应性好，

具有生产衣康酸的天然优势。

首先，本文基于黑曲霉CGMCC10142转录组学分析结果，发现1个在KEGG

数据库中注释为编码顺乌头酸脱羧酶的基因，通过过表达该基因，推测其可能在

催化顺乌头酸脱羧的过程中发挥作用。本实验以黑曲霉59号（敲除编码柠檬酸

转运蛋白的cexA基因）作为出发菌株，构建PglaA启动土曲霉来源的At_aco（编

码顺乌头酸酶）表达质粒pCG，通过根癌农杆菌AGL1介导的遗传转化获得黑

曲霉pCG-15菌株。继续构建由Pgas启动的黑曲霉来源的An_cadA（编码顺乌头

酸脱羧酶）表达质粒pd5，经根癌农杆菌AGL1介导侵染pCG-15菌株，获得黑

曲霉转化子15-19。通过摇瓶发酵，15-19菌株发酵液上清中没有衣康酸生成，破

碎菌体测定胞内衣康酸产量为2.55mg/L，较出发菌株59号提高了83.5%。qRT-

PCR分析表明15-19菌株中衣康酸合成相关基因At_aco、An_aco和An_cadA表

达量均上调。

其次，通过过表达土曲霉来源的衣康酸代谢途径关键基因，提高黑曲霉胞内

衣康酸产量。构建表达土曲霉来源At_cadA的质粒pCA，通过根癌农杆菌AGL1

介导遗传转化至pCG-15菌株中获得pCA-24菌株。通过摇瓶发酵，与出发菌株

黑曲霉59号相比，发酵液上清中均未检测到衣康酸，pCA-24胞内衣康酸产量为

3.11mg/L，较出发菌株59号提高了123.7%，比15-19菌株提高了22.0%。

最后，通过加强衣康酸转运系统，优化黑曲霉发酵生产衣康酸的条件，进一

步提高黑曲霉分泌衣康酸水平。构建共过表达土曲霉来源At_cadA和mfsA（编

码衣康酸膜转运蛋白）的质粒pCAM，经由根癌农杆菌AGL1介导转化至pCG-

15菌株中，筛选获得一株过表达土曲霉来源的At_aco、At_cadA和mfsA的转化

子pCAM-80。通过单因素实验法确定pCAM-80菌株发酵最适pH值为4.0，在

单因素实验的基础上进行正交实验优化培养基组成，主要从氮源浓度和金属离子

添加量两方面进行优化，优化后的培养基为：葡萄糖160g/L、(NH)SO4g/L、

424

玉米浆3mL/L、糊精10g/L、KHPO0.25g/L、玉米油0.1%、MgSO·7HO0.4

2442

g/L、CuSO·5HO0.15g/L、ZnSO·7HO0.15g/L、FeSO·7HO0.05g/L、尿苷添

424242

加量为2.442g/L。通过单因素实验确定发酵最适温度为33℃，在此条件下衣康

酸产量为105.40mg/L。经qRT-PCR分析，与黑曲霉59号相比，pCAM-80菌株

在发酵3.5d和4.5d时调节衣康酸合成相关基因At_aco、An_aco、At_cadA、mfsA

均能有效表达。

关键词：黑曲霉；衣康酸；aco；cadA；mfsA

ABSTRACT

Itaconicacidisanimportantbiomass-derivedmonomermoleculeinorganic

syntheticpolymericmaterials,andAspergillusniger,asamicrobialcellfactorywith

highcitricacidproduction,notoxinproduct