酶的分离与纯化.ppt

各种双水相系统双水相系统的应用12沉淀法;2)相分配法;3)柱层析法;4)电泳或离心法。根据原理,酶的纯化方法分为:建立方便灵敏的分析方法;选择有效的纯化方法;尽量避免变性;尽量避免过度暴露于空气中.酶纯化的基本原则:二、酶的精制酶的理化性质与分离纯化方法理化性质分离及纯化方法分子大小和形态溶解度电荷差异生物功能专一性差速离心、超滤、分子筛、透析盐析、萃取、分配层析、结晶电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析亲和层析126543原理利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质等的差别,对于各种薄膜表现出不同的可透性而达到分离的目的。膜分离技术分为反渗透(RO)、超滤(UF)、纳滤(NF)、微滤(MF)。主要区别在于膜孔径的大小。酶纯化中常用的是超滤和微滤,特别是浓缩和脱盐。123456膜分离几种膜分离技术特点1、透析(dialysis)原理P1591)透析膜纤维素或其衍生物制成。透析袋已经商品化。2)透析袋预处理3)透析方法及装置2.超滤原理P164-165利用具有一定孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。这种利用超滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法。超滤膜的截留分子量范围从5000到500000。超滤工作示意图透析方法示意图（二）凝胶过滤法(gelfiltration)原理凝胶的种类交联葡聚糖凝胶结构的示意图葡聚糖凝胶的种类和规格凝胶过滤技术凝胶过滤技术的应用（三）离子交换层析(IonExchangeChromatography,IEC)原理离子交换吸附洗脱示意图2、离子交换剂3、离子交换技术：P182（四）疏水层析(HydrophobicChromatography)1、原理一些疏水性较强的介质对疏水性较大的蛋白质有较强的吸附作用，而且吸附后不容易被洗脱下来。尽管多数蛋白质都溶于水，具有较强的亲水性，但实际上分子内部都存在着一个疏水核心中心，分子构象十分复杂。分子内部都不同程度存在着一些疏水基团或疏水中心区。如蛋白质表面含有某些非极性氨基酸侧链，其中包括Leu、Phe、Trp、Ala、Pro等氨基酸，这些非极性氨基酸侧链组成了蛋白质疏水核心中心，决定了蛋白质的疏水性质。P188第四章酶的分离与纯化

一、酶的分离二、酶的精制三、电泳四、酶的浓缩五、酶结晶0102030405预处理和固液分离：加速固液相分离细胞破碎分离胞内产物产品加工初步纯化（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质高度纯化（精致）：除去与产物性质相似的杂质一般程序发酵液预处理目的：改变发酵液物理性质尽可能使产物转入便于后处理的某一相中去除部分杂质12一、酶的分离01040203无机离子的去除Ca2+常用草酸Mg2+三聚磷酸钠，生成可溶性络合物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+Fe3+黄血盐[K4Fe(CN)6],形成普鲁(Fe4[Fe(CN)6]3)沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3?+12K+1、发酵液的相对纯化(2)杂蛋白质的去除1）沉淀法机理主要是破坏电荷。酸性溶液中与一些阴离子如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等形成沉淀。碱性溶液中与一些阳离子如Ag2+Cu2+Zn2+Fe3+Pb2+等形成沉淀2）变性法蛋白质因变性导致溶解度下降而被除去。常见的如加热、大幅度调pH、加有机溶剂和表面活性剂等。3）凝聚和絮凝用Al2(SO4)3等凝聚剂使蛋白质胶体体系不稳定，通过相互碰撞发生凝集。形成的颗粒较细。絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂（如聚丙烯酰胺类衍生物）的架桥作用下将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。形成的颗粒较粗，用量小，速度快。4)吸附法(3)色素及其他物质的去除活性炭：0.1-1.5%离子交换树脂如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋白质2、发酵液的固-液分离离心和过滤菌种对过滤速度影响很大真菌容易过滤，放线菌则难培养基组成对过滤也有影响（二）细胞破碎1、细胞壁与细胞破碎2、细胞破碎的方法1）机械法：珠磨法（beadmill）实验室：Mickle捣碎机；中试：胶质膜处理；工业：高速珠磨