细胞生物学研究方法(IV).ppt

电子显微镜的基本构造=1?10-13sec.S=(dx/dt)/?2x差速离心2、大分子分离--层析技术离子交换凝胶过滤亲和层析3、电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳琼脂糖凝胶电泳（核酸）原理：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。类型：免疫荧光技术免疫印迹反应免疫电镜技术免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术（二）特异蛋白抗原的定位与定性（三）细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交技术放射性同位素标记：利用放射性核素所放射出来的射线作用于感光材料的AgCl晶体，从而产生潜影，并通过显影过程把“像”显示出来，以研究用放射性核素标记的物质在生物体内的定位和定量的一种技术。生物素标记（四）定量细胞化学分析与细胞分选技术添加标题福尔根反应：测定DNA含量添加标题PAS反应：检测多糖添加标题苏丹Ⅲ染色：检测脂滴添加标题米伦反应：检测蛋白质细胞成分的细胞化学显示方法流式细胞术可定量测定细胞中DNA、RNA或某一特异的标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量；它还可以将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来，甚至可用于细胞的分选。三、细胞培养与细胞工程细胞培养细胞工程（一）细胞培养技术动物细胞培养原代细胞培养传代细胞培养培养方法：贴壁培养、悬浮培养植物细胞培养愈伤组织诱导4)细胞悬浮培养继代培养5)细胞团或愈伤组织再形成单细胞分离6)植株的再生（二）细胞工程细胞融合（cellfusion）与细胞杂交（cellhybridization）技术重组DNA技术单克隆抗体（monocloneantibody）技术细胞拆合与显微操作技术1、细胞融合技术两种或两种以上细胞融合在一起的技术病毒诱导，PEG，电击融合植物和微生物用原生质体应用：很广，如杂交瘤2、重组DNA技术传统的DNA扩增：分子克隆法聚合酶链反应PCR(polymerasechainreaction)DNA顺序分析PCR1983年由美国PE-Cetus公司的Mullis等发明，1985年公开报道的一种体外核酸扩增系统。原理：由引物（模板片段两端的已知序列）介导，聚合酶（如TaqDNA聚合酶，依赖于模板）催化底物（4种脱氧核苷酸），在体外进行特异DNA（目的基因等）扩增（或合成）的一种方法。单击此处可添加副标题步骤：变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；退火：突然降温后模板与引物按碱基配对原则互补结合；延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，以单核苷酸为底物，从引物的3’端开始合成，形成了与模板链互补的新DNA链。循环一次，DNA量增加一倍；经过25-30个循环，DNA可扩增106-109倍。优点：快速（数小时）、灵敏（ng）、操作简便（自动化）等。单击此处添加大标题内容3、单克隆抗体技术每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。4、显微操作技术仪器：显微操作仪显微操作的应用显微注射：标记蛋白、外源DNA的导入核移植转基因动植物动物克隆动物克隆生物繁殖后代通常是以精、卵细胞结合的有性生殖方式进行。通过营养体细胞繁殖个体的方法称为无性繁殖。克隆是指离体条件下的无性繁殖。1981年Illmenses率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。随后，1984年Willadsen用未成熟羊胚细胞核克隆出一头羊。英国PPI生物技术的罗斯林（Roslin）研究所的维尔穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在世界著名权威杂志《Nature》宣布的用乳腺细胞的细胞核克隆出一只绵羊“多莉(Dolly)”的消息。“多莉”的诞生，既说明了体细胞核的遗传全能性，也翻开了人类以体细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章。此项技术因而荣登美国《Science》周刊评出的1997年十大科学发现的榜首。绵羊B乳腺细胞核易核卵融合卵绵羊C子宫多莉植入植入生产克隆多莉羊示意图取出未受精卵去核电激体外胚胎发育绵羊A“多莉”的产生与三只母羊有关；一只是芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，