荧光定量PCR原理、对照检测、对照选择及荧光定量PCR临床应用.doc

荧光定量PCR原理、对照检测、对照选择及荧光定量PCR应用

荧光定量PCR原理

荧光定量PCR是在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析方法。

传统的PCR进行检测时，扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离，只能作定性分析，不能准确定量，易造成污染出现假阳性导致应用受到限制。实时定量PCR技术实现对模板定量且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点，使荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。?

??荧光定量PCR中对照

对照目的是对检测各个环节监控，按照检测流程对照梳理。??

常规荧光定量PCR流程是：样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录病毒）-扩增-结果读取。

1、阳性对照和阴性对照。阳性对照和阴性对照是在相同处理条件下，阴阳性对照强调处理过程与样品一致且有明确的预期结果。

2、扩增对照。阳性对照和阴性对照是扩增试剂盒中附带不需提取阳性对照和阴性对照，扩增阳性对照含有阳性扩增模板，扩增阴性对照应含有阴性扩增模板，不能监控采样、提取和每份样品操作过程。

3、内标。内标是在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子。内标有两种形式，一种是使用天然样品中含有的内参基因作为内标，另一种是人工添加内标。内标最大特点是与靶序列共同扩增，其他对照都是独立扩增。

（1）内参基因

内参基因是持家基因，常用内参基因包括GAPDH、β-actin、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。

内参基因优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序，可以监控采样，运输，核酸提取和扩增的全部过程。缺点是不同物种，不同生理状态下，不同组织中的内参基因存在一定的差异。

（2）人工内标

核酸提取对照。可使用内参基因，假病毒混合基质，灭活病毒混合基质来监控提取到扩增流程。

反转录对照。可以使用提取好RNA内参基因，RNA假病毒混合基质，灭活RNA病毒混合基质来监控反转录到扩增的流程。

空白对照

（1）无模板空白对照。NTC是不含有模板的对照。目前试剂盒都是水或阴性缓冲液，NC等同于NTC。

（2）仪器空白对照。NTC是含有引物探针和反应液主要监控引物探针，反应体系有没有被污染。

（3）荧光染料对照。使用是ROX染料，荧光定量PCR荧光信号在每个样品孔会有微小的差异，使用特定ROX荧光染料，系统可以根据ROX荧光染料信号值来校准每孔荧光信号。

质控品。环节中使用各种对照大部分是试剂匹配试剂盒使用产品，整个监控过程存在不够客观和独立。

定值参考品。定量检测试剂盒需要配套定值参考品用于试剂盒定量检测使用。

对照选择

阳性对照与污染

不阳性对照可以增加实验室污染的风险，污染来源是直接来源于扩增阳性对照的污染，另一种污染来自于扩增产物的处理不当或者实验室的设计布局不合理。

初筛和确诊

需要检测系统达到最高检测效率，在不同环节添加阳性对照，确保每个环节检测效率最高。

确诊实验提高诊断特异性，需要确保检测系统不出现假阳性，在不同环节添加阴性对照，减少非必须阳性对照。

?荧光定量PCR应用

分子生物学研究????

1、核酸定量分析：对传染性疾病定量定性分析，病原微生物或病毒含量检测。

2、基因表达差异分析：比较经过不同处理样本之间特定基因

表达差异，特定基因在不同时相表达差异以及cDNA芯片或差显结果确证。?

3、SNP检测：分子信标结构巧妙性，SNP序列信息是已知，采用技术高通量SNP检测将会变得简单而准确。

4、甲基化检测：甲基化同癌症等许多疾病有关。

医学

1、产前诊断：对遗传性物质改变引起遗传性疾病无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止遗传性疾病发生。

2、病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体定量测定，具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。

3、药物疗效考核：HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗中，HBV-DNA血清含量曾有下降，随后再度上升或超出以前水平，提示病毒发生变异。

4、肿瘤基因检测：实时荧光定量PCR能有效地检测到基因突变，可以准确检测癌基因表达量，方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基