临床免疫学检验PPT课件 化学发光免疫技术.pptx

第九章化学发光免疫技术医学检验技术专业新型课程体系

目录CONTENTS第一节第二节第三节直接化学发光免疫试验化学发光酶免疫试验第四节电化学发光免疫试验发光氧通道免疫试验第五节方法学评价及临床应用

PARTONE第一节直接化学发光免疫试验

化学发光第一节直接化学发光免疫试验1.化学发光可根据参与化学反应中不同化合物的发光特性，可以分为直接化学发光和间接化学发光。2.常见的直接化学发光剂有吖啶酯（acridiniumester，AE）、鲁米诺及其衍生物异鲁米诺。但由于鲁米诺作为酶促反应发光剂优于直接标记发光，目前常用的直接标记发光剂有吖啶酯和异鲁米诺。

一、基本原理基本原理1.抗原抗体反应吖碇酯标记抗体（或抗原）与待测标本中相应的抗原（或抗体）发生免疫反应，形成抗体-待测抗原-吖碇酯标记抗体复合物。2.化学发光加入氧化剂NaOH-H2O2形成碱性环境，吖碇酯在不需要催化剂的情况下，分解为激发态产物N-甲基吖啶酮，发出波长为470nm的光。3.通过集光器和光电倍增管接收，记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原（或抗体）的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。第一节直接化学发光免疫试验

二、方法类型1.夹心法（双抗体夹心法）（1）检测大分子抗原常采用双抗体夹心法：吖碇酯等直接标记抗体（或抗原），与待测标本中相应的抗原（或抗体）发生免疫反应，形成抗体-待测抗原-吖碇酯标记抗体复合物，加入氧化剂NaOH-H2O2形成碱性环境，吖碇酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。第一节直接化学发光免疫试验

方法类型：双抗体夹心法。第一节直接化学发光免疫试验双抗体夹心法

（2）检测小分子抗原的夹心法（非竞争法）：基于抗免疫复合物抗体的非竞争性法为例。固相包被的抗体（识别单独抗原分子的表位），先与待测标本中相应的抗原发生特异性结合反应，形成免疫复合物，然后加入吖碇酯等直接标记的抗异型抗体（识别免疫复合物的新表位），形成固相抗体-待测抗原-吖碇酯标记抗异型抗体，加入氧化剂NaOH-H2O2形成碱性环境，吖碇酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。第一节直接化学发光免疫试验

2.竞争法当标记抗原和待测抗原对同一种抗体有相同的亲和力，在抗体限量的条件下，两种抗原与抗体发生竞争性结合，通过检测标记抗原-抗体复合物的信号强度，间接检测待测抗原的含量。第一节直接化学发光免疫试验

方法类型：竞争法。第一节直接化学发光免疫试验竞争法

（一）碱性条件吖啶酯的发光反应需要在碱性条件下进行。标记复合物反应过程中需要加入氧化剂（过氧化氢和氢氧化钠）形成碱性环境，发光过程需要在碱性条件下，经过氧化氢氧化，从而进行分解和发光。（二）温度除此之外，吖啶酯的发光反应会受到温度的影响，过高或过低的温度都会影响发光效果。三、影响因素第一节直接化学发光免疫试验

（三）激发试剂吖啶酯需要加入激发试剂才能发光。在碱性条件下，吖啶酯产生电子转移反应，从而获得足够的能量，产生激发态的吖啶酯分子。当激发态的分子回到基态时，释放光子，从而实现发光。然而，这个过程需要消耗能量，因此需要加入激发试剂来提供所需的能量。（四）试剂因素吖啶酯是一种重要的化学试剂，在诊断试剂盒的制备中具有广泛的应用。使用时需要注意试剂的质量控制、操作条件、储存条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。第一节直接化学发光免疫试验

PARTTWO第二节化学发光酶免疫试验

一、基本原理和方法类型基本原理：1.抗原抗体反应通过能催化激发某一化学反应的酶如辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）或碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）来标记抗体（或抗原），与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物。第二节化学发光酶免疫试验

2.化学发光经洗涤后，加入底物（酶促发光剂），酶催化和分解底物发光。3.通过集光器和光电倍增管接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。化学发光酶免疫实验的反应原理与酶联免疫吸附试验（ELISA）相似。两者不同点主要在于化学发光酶免疫实验中酶作用的底物为发光底物。第二节化学发光酶免疫试验

方法类型1.辣根过氧化物酶标记的化学发光酶免疫反应（1）HRP-过氧化氢-鲁米诺发光体系：鲁米诺是一种化学荧光分子。在碱性条件下，辣根过氧化物酶催化鲁米诺和过氧化氢的氧化反应，波长可在425nm下进行检测。（2）HRP-过氧化氢-鲁米诺-增强剂发光体系：传统的HRP-过氧化氢-鲁米诺发光体系发光量低、不易测量，在传统的发光体系中加入