褐黄孢链霉菌那他霉素基因簇中ntmL功能研究.pdfVIP

摘要

那他霉素（natamycin）又称游链霉素（streptomycin）或匹马菌素（pimaricin）,属

于多烯大环内酯类真菌抗生素。主要用于食品抗真菌防腐剂，同时在临床上也用于真

菌感染的预防和治疗。纳塔尔链霉菌、褐黄孢链霉菌等多个链霉菌能够天然产生那他

霉素。从这些天然产生菌中发现的那他霉素生物合成基因簇具有保守的结构和组成特

征。有20个基因保守成簇存在于那他霉素产生菌中，其中19个基因已被证实或有清

晰的功能预测分别参与了那他霉素的合成、转运或调控的过程。而其中一个酪氨酸磷

酸酶编码基因（褐黄孢链霉菌中对应ntmL基因）是那他霉素基因簇中唯一一个没有

被证实是否参与那他霉素产生的基因。为了便于那他霉素高产菌株的基因工程育种，

本研究以褐黄孢链霉菌为研究材料，取得的研究成果如下：

（1）传统方法构建ntmL基因敲除突变株：采用同源重组双交换的策略，将卡那

霉素抗性基因替换ntmL,，构建了ntmL敲除菌株S3176。菌株发酵显示ntmL敲除菌

株S3176丧失了那他霉素的产生能力。进一步ntmL互补实验显示回补菌株并没有恢

复那他霉素的产生能力。上述结果表明S3176菌株那他霉素合成能力的丧失是由于卡

那霉素抗性基因的插入所造成的极性效应引起的，而不是ntmL基因敲除引起的。

（2）新型基因无痕敲除方法的建立：我们采用现有的链霉菌基因无痕敲除方法

（如CRISPR/Cas9系统和基于IdgS的蓝白斑筛选系统）对ntmL分别进行基因敲除，

发现这些方法在褐黄孢链霉菌中均不适用。基于褐黄孢链霉菌转化效率较高的特点，

我们对蓝白斑筛选无痕敲除系统进一步改造，采用强启动子-PermE驱动的、来自大肠

杆菌胞嘧啶脱氨酶突变体D314A编码基因codA(Sm)作为反向选择标记代替IdgS蓝

色素合成基因构建了新型无痕敲除系统。该系统在模式链霉菌S.lividansTK24中得到

成功应用：在sLIV12945-sLIV12950双基因敲除的同时，插入了一个36bp的attB位点

获得了无选择性标记菌株S3175（S.lividansΔsliv12945-sliv12950::attB）。该菌株的成功

构建，表明以codA为反向筛选标记的新型无痕敲除系统的成功建立。

（3）ntmL的无痕敲除：采用新建立的新型无痕敲除系统，我们成功构建了ntmL

无痕敲除突变株S3172。突变株S3172在生长及产孢情况与野生型菌株S139相比均

没有明显变化。摇瓶发酵发现敲除菌株S3172那他霉素的产量达853.51mg/L，比野

生型菌株S139提高了15%。该结果表明ntmL对那他霉素的产生具有负调控功能。基

因回补和过表达实验进一步证实了ntmL负调控那他霉素的产生：回补菌株S3174那

他霉素产量达732mg/L，与野生型菌株产量相当，而ntmL过表达菌株S3173那他霉

素产量达686.78mg/L，比野生型降低了7.8%。

综上所述，本研究建立了一种以codA作为反选标记的新型无痕敲除系统，该方

法不仅可以在模式菌株TK24里应用，而且还能广泛应用于工业菌株，实现目的基因

无痕编辑。我们采用新型无痕敲除系统，揭示了ntmL对那他霉素产生的负调控功

能，该研究发现对于那他霉素高产工程菌株的构建具有重要意义。

关键词:那他霉素；褐黄孢链霉菌纳他霉素基因簇；反选标记基因codA；ntmL基因；

敲除方法

ABSTRACT

Natamycin,alsoknownasstreptomycinorpimaricin,isapolyenemacrolidefungal

antibiotic.Itismainlyusedasafoodantifungalpreservative,andisalsousedclinicallyfor

thepreventionandtreatmentoffungalinfections.Severalstreptomyces,suchasStreptomyces

natalensisandStreptomycesgilvosporeus,cannaturall