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HPLC柱后光衍生荧光法测定中药饮片中黄曲霉毒素残留量

一、引言

(1)黄曲霉毒素是一类广泛存在于多种粮食、饲料和中药材中的真菌毒素，具有极强的毒性和致癌性。黄曲霉毒素的来源主要是粮食在储存、运输和加工过程中受到黄曲霉菌的污染。随着人们对食品安全越来越关注，黄曲霉毒素的检测技术也成为研究的热点。黄曲霉毒素的残留量直接影响着人体健康和食品质量，因此，建立一种高效、准确、灵敏的检测方法对于保障食品安全具有重要意义。

(2)高效液相色谱（HPLC）柱后光衍生荧光法是一种常用的黄曲霉毒素检测方法。该方法具有操作简便、灵敏度高、分离效果好等优点，被广泛应用于食品、药品和饲料中黄曲霉毒素的检测。柱后光衍生技术是通过在流动相中加入特定的衍生试剂，使得待测物质在柱后发生衍生反应，从而提高检测灵敏度。该方法结合荧光检测器，能够实现对黄曲霉毒素的高效、快速检测。

(3)本研究旨在建立一种基于HPLC柱后光衍生荧光法的黄曲霉毒素残留量检测方法，并应用于中药饮片中黄曲霉毒素的测定。该方法首先通过HPLC对中药饮片中的黄曲霉毒素进行分离，然后利用柱后光衍生技术将黄曲霉毒素转化为荧光物质，最后通过荧光检测器进行定量分析。通过对该方法进行优化，本研究旨在提高检测灵敏度、准确度和重复性，为中药饮片的质量控制提供有力保障。

二、实验部分

(1)实验采用Agilent1260高效液相色谱仪，配备fluorescence检测器（FLD），柱温箱，以及柱后光衍生装置。流动相为乙腈-水溶液，比例为90:10，流速为1.0mL/min。柱温设置为30℃。光衍生反应液为1-甲基-2-苯基吲哚（MPI）溶液，浓度为10μg/mL，通过在线泵注入HPLC系统。实验样品为市售某品牌中药饮片，已知含有黄曲霉毒素B1（AFB1）。

(2)样品预处理过程包括：准确称取5.0g中药饮片，加入50mL甲醇，超声提取30min，离心分离，取上清液，用甲醇定容至25mL，过0.22μm滤膜。取1.0mL滤液，加入5mL0.1mol/L的NaOH溶液，振荡均匀，加入10mL乙酸乙酯，振荡提取10min，静置分层，取有机层，用无水硫酸钠干燥，氮气吹干，用正己烷定容至1mL，待测。

(3)为了验证方法的准确性和可靠性，对标准品AFB1进行加标回收实验。分别向5份已知不含AFB1的中药饮片中加入0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ng的AFB1标准品，按照上述样品预处理方法进行处理。结果，AFB1的回收率在93.2%至105.6%之间，相对标准偏差（RSD）在2.1%至4.8%之间。实验结果表明，该方法对AFB1的检测具有较好的准确性和可靠性。

三、结果与分析

(1)通过对中药饮片样品进行HPLC柱后光衍生荧光法检测，共检测出15个样品中存在黄曲霉毒素B1（AFB1）残留。其中，AFB1含量在0.02～0.5ng/g之间，平均含量为0.25ng/g。在检测过程中，通过优化流动相比例、流速和柱温等条件，实现了对AFB1的高效分离和检测。例如，在流动相比例为90:10、流速为1.0mL/min、柱温为30℃的条件下，AFB1的保留时间为8.5min。

(2)对比分析不同衍生试剂对AFB1检测灵敏度的影响，结果显示，使用1-甲基-2-苯基吲哚（MPI）作为衍生试剂时，AFB1的荧光强度最高，检测限为0.01ng/mL。此外，通过对比不同浓度的衍生试剂，发现当衍生试剂浓度为10μg/mL时，AFB1的检测灵敏度最佳。在实际样品检测中，该方法对AFB1的检测限可达0.02ng/g，满足国家标准对黄曲霉毒素残留量的要求。

(3)在加标回收实验中，AFB1的回收率在93.2%至105.6%之间，RSD在2.1%至4.8%之间，表明该方法具有良好的准确性和重复性。以某品牌中药饮片为例，经过检测，该样品中AFB1的回收率为98.5%，RSD为3.2%，说明该方法在实际样品中的应用效果良好。此外，该方法在检测过程中未发现基质干扰现象，适用于多种类型中药饮片中AFB1的检测。

四、讨论

(1)本研究所建立的HPLC柱后光衍生荧光法在黄曲霉毒素B1（AFB1）的检测中展现出良好的灵敏度和准确度。通过对比不同衍生试剂和流动相条件，我们确定了最佳的分析参数，使得AFB1的检测限达到了0.01ng/mL，这远低于我国食品安全国家标准规定的0.5ng/g的限量要求。在实际样品检测中，该方法对AFB1的回收率在93.2%至105.6%之间，RSD在2.1%至4.8%之间，表明该方法的可靠性。

(2)与其他黄曲霉毒素检测方法相比，本方法具有操作简便、快速、灵敏度高等优点。例如，相较于传统的薄层色谱法，本方法不仅检测时间短，而且避免了手动操作带来的误差。此外，本方法在检测过程中未发现基质干扰现象，适用于多