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鼠源单克隆抗体制备通用技术要求

1范围

本文件规定了鼠源单克隆抗体（以下简称“鼠单抗”）制备的技术要求、人员要求、设施设备与生产环境、生产和质量控制、抗体制品的检验要求。

本文件适用于鼠源单克隆抗体制品的生产。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过对文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB14925

实验动物环境及设施

GB/T25915.1-2010

洁净室及相关受控环境第1部分空气洁净度等级

GB51110

洁净厂房施工及质量验收规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

骨髓瘤细胞

B-淋巴浆细胞系统恶性增殖所致一种肿瘤。

3.2

抗原

能诱导机体发生免疫应答的物质。

3.3

杂交瘤细胞

用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。

3.4

饲养细胞

帮助其它活的细胞在体外细胞培养中生存与繁殖的细胞。

3.5

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腹水

将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于BALB/C小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含有单抗的腹腔积液。

4技术要求

4.1制备流程

4.1.1鼠单抗制备流程见图1。

4.1.2图1中骨髓瘤细胞培养、骨髓瘤细胞筛选、细胞融合、HAT选择性培养的制备过程应在洁净室内完成。

4.1.34.1.2条中的洁净室空气洁净度等级应符合GB/T25915.1-2010中ISO7级的要求。

图1鼠单抗制备流程图

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4.2过程要求

4.2.1细胞融合前准备

脾细胞悬液准备

.1小鼠免疫

.1.1应选用检疫合格的纯种“BALB/C”小鼠，在细胞融合前两个月左右选择合适的免疫方案对小鼠进行免疫。

.1.2小鼠免疫方案按抗原性质分为：

a)可溶性抗原免疫方案；

b)颗粒抗原免疫方案。

.2免疫小鼠检测

小鼠免疫后应进行免疫小鼠血清滴度测定检测。

.3脾细胞悬液准备

.3.1应使用血清滴度测定检测合格的免疫小鼠进行脾细胞悬液准备。

.3.2应在免疫小鼠加强免疫3天后将小鼠拉颈处死。

.3.3应在无菌环境下获取免疫小鼠脾脏制备成脾淋巴细胞悬液。

骨髓瘤细胞培养

采用的骨髓瘤细胞应和免疫动物（小鼠）属于同一品系。

.1骨髓瘤细胞准备

应选取对数生长骨髓瘤细胞。

.2骨髓瘤细胞筛选

.2.1融合前应对骨髓瘤细胞进行筛选，确保无细菌、霉菌及支原体污染时方可用于细胞融合。

.2.2经筛选后残留有不符合要求细胞的培养皿应按4.2.11条的要求进行处理。

4.2.2细胞融合

准备好的骨髓瘤细胞和脾细胞悬液应按1：10～1：5的比例进行混合。

混合后的细胞应弃净上清。

弃净上清后，应用含10%小牛血清HAT选择培养液重悬。

混合后的细胞应按每孔100μl的剂量，加入到已有饲养细胞层的96孔培养板中，置于37℃、

5%CO2培养箱中进行培养。

4.2.3HAT选择性培养

融合后的细胞，应在HAT选择培养液中进行培养。当培养10天左右，应根据细胞密度，进行

杂交瘤细胞筛选。

HAT选择培养期间应在融合后3天～5天更换一半培养液。

4.2.4杂交瘤细胞筛选

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应以快速、简便、特异、敏感为原则，根据抗原的性质、抗体的类型，选择不同的筛选方法，

筛选出阳性母克隆细胞。

经筛选后残留有不符合要求细胞的培养皿应按4.2.11条的要求进行处理。

4.2.5单克隆化

应在克隆前一天按要求准备已有饲养细胞层的96孔培养板。

连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能

保持稳定分泌特异性抗体。

4.2.6单克隆细胞株筛选

应按要求对阳性单克隆细胞株进行筛选后，用合格的阳性单克隆细胞株抗体进行腹水的大量生产或培养上清的收集。

4.2.7腹水生产/培养上清收集

应挑选10周龄至26周龄的健康纯种“BALB/C”小鼠，进行腹水的大量生产。

腹水收集完后，应观测杂交瘤细胞在腹水中的含量，并留样0.2ml，备腹水滴度测定用。

应将过度生长的杂交瘤细胞培养上清，收集于无菌离心管中，离心弃沉淀，收集上清。

所有保存腹水和上清的收集管上应写明项目名称、克隆号、腹水/上清数量、生产日期等。

4.2.8单克隆抗体纯化

应尽可能选用不引起免疫球蛋白聚合、变性等的纯化方法及条件。

应验